高效液相色谱方法与应用

色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，是一个具有强大生命力的分离分析技术。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。第1页，共33页。高效液相色谱法的特点

一、与经典液相色谱法比较

经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。

高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。第2页，共33页。二、与气相色谱法比较

气相色谱仅能测量在操作温度下可气化且不分解的物质，而对高沸点化合物、非挥发性物质、

第3页，共33页。

热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离及测量有困难，致使其应用受到了很大的限制。

高效液相色谱法不受样品挥发度和热稳定性的限制，适合分离生物大分子、离子型化合物、不稳定的天然产物以及其他各种高分子化合物等。

据统计，在已知化合物中，能用气相色谱测量的约占20％；能用高效液相色谱测量的达到70％～80％。

三、高效液相色谱法的特点

1.分离效能高

2.选择性高

3.检测灵敏度高

4.分析速度快第4页，共33页。高效液相色谱法的分类

按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类1.吸附色谱（AdsorptionChromatography）2.分配色谱（PartitionChromatography）3.离子色谱（IonChromatography）4.体积排阻色谱（SizeExclusionChromatography）5.键合相色谱法（bonded-phasechromatography）6.亲和色谱（AffinityChromatography）第5页，共33页。按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较

吸附色谱分配色谱离子色谱体积排阻色谱亲和色谱固定相

全多孔固体吸附剂

固定液载带在固相基体上

高效微粒离子交换剂

具有不同孔径的多孔性凝胶

多种不同性能的配位体键联在固相基体上

流动相

不同极性有机溶剂

不同极性有机溶剂和水

不同pH值的缓冲溶液

有机溶剂或一定pH值的缓冲溶液

不同pH值的缓冲溶液，可加入改性剂

分离原理

吸附与解吸

溶解与挥发

可逆性的离子交换

多孔凝胶的渗透或过滤

具有锁匙结构络合物的可逆性离解

第6页，共33页。高效液相色谱仪简介

1.贮液瓶

2.高压输液泵

3.进样器

4.色谱柱

5.检测器

6.记录装置第7页，共33页。贮液罐(流动相)一、流动相脱气

（1）吹氦脱气法

（2）加热回流法

（3）抽真空脱气法

（4）超声波脱气法

（5）在线真空脱气法第8页，共33页。高压输液泵及梯度洗脱装置

一、高压输液泵

高压输液泵可以分为以下两类：1．恒流泵：可输出恒定体积流量的流动相。（1）注射式泵（又称注射式螺杆泵）（2）往复型泵2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力的泵。

第9页，共33页。二、梯度洗脱装置

1．梯度洗脱（gradientelution）又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。2．梯度洗脱特点：提高柱效以及改善检测器的灵敏度。第10页，共33页。进样装置

液相色谱常用的进样方式有三种：直接注射进样、停流进样和高压六通阀进样。直接注射进样的优点是操作简便，并可获得较高的柱效，但这种方法不能承受高压。停流进样是在高压泵停止供液、体系压力下降的情况下，将样品直接加到柱头。这种进样方式操作不方便，重现性差，仅在不得已时才使用。高压六通阀进样的优点是进样量的可变范围大、耐高压、易于自动化，但容易造成谱峰柱前扩宽。第11页，共33页。色谱柱

多用内壁抛光的不锈钢制成，内径2～6mm，直形柱柱长l0～l00cm。

在需要增加柱长时，可使用死体积小的连接管，把几根直形柱串接起来。第12页，共33页。检测器

用于液相色谱中的检测器，应具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应快、死体积小等特点，还应该对温度和流速的变化不敏感。

液相色谱法中有两种基本类型的检测器：

一类是选择性检测器，如紫外一可见分光光度检测器；

另一类是通用型检测器，如示差折光检测器。第13页，共33页。(1)紫外一可见分光光度检测器。

是一种应用广泛，灵敏度和测量精度都比较高约选择性检测器。

它的检测原理基于被测组分对特定波长的紫外一可见光的选择性吸收，被测组分浓度与吸光度的关系服从朗伯一比尔定律。

它适用于在紫外和可见区有吸收的样品。

第14页，共33页。

(2)示差折光检测器。

示差折光检测器是根据流动相中出现组分时，流动相折射率发生变化而设计的。

溶液的折射率等于流动相折射率与其浓度的乘积，加上组分折射率与其浓度的乘积。

示差折光检测器为通用型检测器，凡具有与流动相折射率不同的组分，均可检测且操作简便，但这种检测器灵敏度不高，对温度十分敏感，不能做梯度淋洗。

第15页，共33页。建立高效液相色谱分析方法的一般步骤

通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。

第16页，共33页。下列优良常规操作能够最大限度降低维修费用：使用HPLC级试剂和流动相清洁的仪器、流动相和样品，如果必要，进行过滤保证溶剂的相溶性如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防止污染对仪器的使用、维护和保养进行记录第17页，共33页。高效液相色谱的应用

第18页，共33页。一、

医药方面

1、分离分析药物的组合含量由于一种药剂常含有多组分，色谱方法是既能分离又能定量的方法。如脂溶性维生素片，含有各维生素，用C18柱及含1%碳酸铵的甲醇为流动相。一次即可将各维生素B6、D1、A、E同时分离并定出含量。又如止痛药或退烧药也可用此法分离并测得各组分的含量。第19页，共33页。2、药物生产中进行中间控制生产抗菌素时，首先要了解发酵液中的主体与副产物的存在情况。例如：青霉素、四环素、头孢子菌素、红霉素、庆大霉素等的发酵产物，均可用C18柱和甲醇及缓冲液配制的流动相或用离子对法，分析主体及其副产物的含量。对普鲁卡因酰胺、茶碱等可进行主体含量的测定，对硝酸甘油可测定主体含量及其降解产物，以便保证药物的热量。

第20页，共33页。3、分析药物在体内的残量：这是近来研究新药效能很主要的内容之一，如磺胺类药品在血清及尿中含量也不允许太大，可用C18柱及酸性乙醇为流动相，测定含量后，则可估计最合适的用药剂量。4、测定药物在各种器官中的代谢产物，特别是研究药物的代谢产物在血清中存在的情况。如测血清中的酮酸及戊二酸。测尿中代谢产物更为方便，不需要繁锁的预处理。因为研究尿中的组分能鉴别病人的代谢功能，对病理研究或临床诊断均具有重要的参考价值。

第21页，共33页。二、生化方面

主要方向是分析嘌呤、嘧啶基的核苷或核苷酸及具有相应的肽和蛋白质。

①在细胞核中有种类繁多的核苷酸，可用不同的检测器或酶转移检测器或利用酶反应进行定性测定。用离子交换柱和缓冲游泳梯度淋洗。C18柱用含磷酸的缓冲水溶液的梯度淋洗法均能得到满意的结果。第22页，共33页。②分离RNA、DNA及碎片现在使用硅烷化的硅藻土或长碳链季胺盐涂渍等在上面制成系列填充柱，已能分离t-RNA,r-RNA及DNA碎片。还可利用此技术做RNA碎片的序列分离制备工具，对生物研究起了重要的作用。③氨基酸、肽、蛋白质的分析氨基酸分析主要是制成荧光衍生物或酰氯的衍生物，然后测定其序列。近来也可用高效液相色谱的柱后衍生物法测定其序列。用四烷基氯化胺肽形成离子对或高效凝胶色谱测定蛋白质，其分离效果也很好。④酶的分析酶是在血清及其他生理样品中常有的反应产物，化学分析法操作不便，易造成误差，用色谱技术分析，具有操作简便、快速、准确的特点。第23页，共33页。⑤糖的分析。糖的分析是其它方法较难完成的。如把糖与硼酸缓冲液预选混合，使生成糖-硼酸络合离子，再进行分离。可把蔗乳糖、阿芦糖、果糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、山梨糖、木糖、葡萄糖等几十种，全部分开。也可用胺基柱分离各种天然产物中伯糖的各绷分。第24页，共33页。三、天然产物中主要组分的分析

天然物的组分非常复杂，如中草药中各组分含量多少对药剂作用影响很大。用此技术分离分析，具有简便、快速的特点。氨基柱能分离分析天然物中糖的组分。氰基柱能分离中药紫草及其衍生物的组成。C18柱分离丹参中主要组分儿茶酚、桂皮中桂皮酸、烟草中的酚类化合物、麦角或鸦片中各种植物碱，这些都是近来日益受到重视的结果。第25页，共33页。四、食品分析

分析食品或动物饲料中的维生素含量，是当前食品工业中的重要课题。分析食品中的黄曲霉素及各种香料，又是生产中的常用课题。如今此技术已在分析咖啡中的黄嘌泠、调料中的核苷酸及核苷、果汁中的有机酸、米中的维生素、牛奶中的维生素D等都对食品营养价值提供有效数据。分析食品中的有毒成分，如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。第26页，共33页。五、环境分析

主要针对大气中污染的成分分析，废水和汽车尾气中有害组分的分析。如柴油机排出的颗粒，用有机溶剂溶解后，经色谱分析结果，有多环芳烃的硝基物，这是对人体健康有很大潜在危险的化合物。又如药厂排出的废水中有大量硝酚；染料厂排出废水中的苯胺等。用液相色谱分析简便迅速。第27页，共33页。六、农业分析

农业中需要对各种作物中的营养成分进行各种含量分析。而液相色谱对多糖、脂肪酸蛋白质等分析都是极为有效的方法，因此应用颇为广泛。第28页，共33页。七、高分子材料的分析

高分子工业材料及生物高分子分析是近年来新兴的课题。凝胶色谱是分离分析高分子组成及鉴定其性能的最好方法。高分子材料中填充各种助剂、乳化剂、分散剂等物的分离，色谱技术也独具特点。

第29页，共33页。①控制高分子产品质量在生产工艺中，可利用凝胶色谱测定聚合物小分子杂质。如用凝胶色谱测定环氧树脂中未聚合的双酚A，用C18柱分离小分子环氧化合物，小分子聚苯乙烯或不能成膜的聚脂等，用以鉴定聚合物的质量。

②测定聚合物的分子量分布宽度分子量大小和分子量分布宽度是衡量聚合物质量的一种重要指标，用凝胶色谱可以测定。第30页，共33页。③高温凝胶色谱测聚合物的老化