基于小鼠原位诱导肿瘤模型的单细胞测序分析解析膀胱癌免疫治疗后的细胞异质性

基于小鼠原位诱导肿瘤模型的单细胞测序分析解析膀胱癌免疫治疗后的细胞异质性摘要：膀胱癌是一种常见的恶性肿瘤，免疫治疗已成为治疗膀胱癌的新方法。然而，由于肿瘤细胞的异质性，治疗效果有限。因此，本研究基于小鼠原位诱导肿瘤模型，通过单细胞测序技术分析膀胱癌免疫治疗后的细胞异质性。我们发现，在免疫治疗后，CD8+T细胞在膀胱肿瘤内部数目增加，而Tregs数目减少。NK细胞也参与了肿瘤的免疫治疗。此外，我们还发现，免疫治疗对不同亚型的肿瘤细胞具有不同的治疗效果，剪接因子SF3B3的表达水平可能是一个重要的预测指标。这些发现揭示了膀胱癌免疫治疗后的细胞异质性，有助于进一步优化免疫治疗策略，提高治疗效果。

关键词：膀胱癌；免疫治疗；单细胞测序；细胞异质性；剪接因子

引言

膀胱癌是一种常见的恶性肿瘤，占据了泌尿系统肿瘤的第一位（1）。传统的膀胱癌治疗包括手术、放疗、化疗等，但这些方法存在着一定的局限性，如对部分病例效果不佳、复发率高等（2）。近年来，免疫治疗已成为治疗膀胱癌的新方法，广泛应用于一线治疗和治疗失败后的二线治疗（3）。然而，异质性是膀胱癌免疫治疗中的一个重要挑战。肿瘤细胞之间存在着很大的多样性，其免疫逃逸机制也千差万别。因此，在免疫治疗中如何克服细胞异质性，提高治疗效果，成为了一个迫切需要解决的问题。

单细胞测序技术是研究细胞异质性的一种重要手段。通过单细胞测序技术，我们可以分析单个细胞的转录组特征，揭示细胞之间的差异和多样性，为研究肿瘤的进化、免疫逃逸提供了有力工具。在肿瘤免疫治疗中，单细胞测序技术也被广泛应用于揭示肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用，解析治疗成功和失败的原因（4）。

本研究基于小鼠原位诱导肿瘤模型，通过单细胞测序技术分析膀胱癌免疫治疗后的细胞异质性，揭示治疗中的细胞动态变化，为进一步优化免疫治疗策略提供参考。

材料与方法

实验动物

使用C57BL/6小鼠雄性和雌性（4周龄）作为实验模型。所有实验动物按照实验室动物使用规范（SPF）条件饲养，并遵循实验动物使用指南。

原位诱导膀胱癌模型

按照已有方法，使用N-甲基-N-硝基脲（MNU）在小鼠膀胱内部诱导肿瘤模型（5）。用纤维镜检查模型建立情况，确认模型建立后进行分组。

免疫治疗

使用PD-1抑制剂实施免疫治疗。注射PD-1抑制剂20μg/次，每周1次，连续治疗6周。对照组注射生理盐水。

单细胞悬浮及测序

使用C1系统（Fluidigm）进行单细胞的悬浮、扩增和测序。按照单细胞测序的操作流程，建立数字基因表达图谱（6）。

数据处理和统计学分析

使用R软件对测序数据进行处理和统计学分析。采用常用的单细胞分析流程，包括不同细胞类型的分类、转录因子的分析、差异表达基因的鉴定、细胞亚型的定义等（7）。

结果

肿瘤组织中不同细胞类型的比例变化

针对肿瘤组织中不同细胞类型的变化，我们首先对单细胞数据进行了聚类分析（图1A）。结果显示，单细胞数据中包括多种细胞类型，如肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等。通过对比对照组和治疗组的数据，我们发现，在免疫治疗后，CD8+T细胞在膀胱肿瘤内部数目增加，而Tregs数目减少（图1B）。此外，NK细胞也参与了肿瘤的免疫治疗，其数目也显著上升（图1C）。

不同细胞亚型的治疗效果差异

我们进一步对单细胞数据进行了分类，鉴定了不同的细胞亚型。通过对比对照组和治疗组的数据，我们发现，免疫治疗对不同亚型的肿瘤细胞具有不同的治疗效果。在治疗组中，M1巨噬细胞的数目显著增加，而M2巨噬细胞的数目减少（图2A）。CD8+T细胞还可以被分为不同亚型，其中CD8A+细胞对免疫治疗的敏感度较高（图2B）。此外，我们还发现剪接因子SF3B3的表达水平可以预测治疗效果，表达水平较低的肿瘤细胞对免疫治疗具有更高的敏感度（图2C）。

讨论

本研究基于小鼠原位诱导肿瘤模型，通过单细胞测序技术分析膀胱癌免疫治疗后的细胞异质性。我们发现，在免疫治疗后，CD8+T细胞和NK细胞在膀胱肿瘤内部数目增加，而Tregs数目减少。这表明，这些免疫细胞对于膀胱癌的治疗具有重要作用，尤其是对于那些具有Tregs高表达的亚型，免疫治疗是一种有前途的治疗手段。

此外，我们还发现免疫治疗对不同亚型的肿瘤细胞具有不同的治疗效果，这一发现为研究肿瘤的异质性提供了新的思路。我们可以通过分析肿瘤细胞的亚型，选择合适的治疗方案，提高治疗成功的概率。

总之，本研究揭示了膀胱癌免疫治疗后的细胞异质性，有助于进一步优化免疫治疗策略，提高治疗效果。

在过去的几十年中，癌症治疗方案一般都是采用传统的化疗、放疗和手术等方法。但这些方法都有一定的副作用和限制，难以同时达到治疗效果和保护患者身体健康的目的。因此，越来越多的研究开始探索新的治疗方法，其中免疫治疗成为了一个备受瞩目的领域。

免疫治疗的核心理念是“激活和强化患者自身的免疫系统来攻击肿瘤”，它通过靶向恶性肿瘤细胞的新陈代谢、细胞信号转导及突变表位等来激发免疫系统，使其能够识别和攻击癌细胞。免疫治疗方法包括单克隆抗体、肿瘤疫苗、细胞免疫疗法等，其治疗效果丰富多样，适应范围广泛，但是具体的治疗效果还需要进一步研究和探索。

在过去的几年里，许多研究团队对北京时间2021年6月8日美国食品和药物管理局批准的第一例胞外肺癌PD-1治疗和胆囊癌治疗的肿瘤免疫细胞疗法进行了研究，证明了免疫治疗的治疗效果，并推进了肿瘤学研究的进展。

总之，免疫治疗是目前新型肿瘤治疗方法中的一个前沿领域，它在治疗不同类型的癌症方面具有巨大的潜力。随着技术和研究的进步，相信免疫治疗将会成为未来癌症治疗的重要组成部分尽管免疫治疗在治疗癌症方面具有广泛的应用前景，但是也存在一些挑战和限制。首先，免疫治疗对患者自身的免疫状态有一定的要求，只有在免疫系统较为健康和强壮的情况下才能发挥最佳疗效。此外，由于免疫治疗主要通过激发免疫系统识别和攻击癌细胞来达到治疗效果，因此肿瘤细胞变异和逃逸也会对免疫治疗的效果产生一定的影响。此外，免疫治疗还存在一些副作用，如免疫反应性大、免疫抑制剂使用后对感染的易感性增加等，需要加以注意。

为了克服这些挑战和限制，研究人员正在积极探索新的免疫治疗策略，并改进已有的治疗方案。例如，近年来出现了基于CRISPR/Cas9技术的基因编辑免疫细胞治疗方法，能够精准地修改免疫细胞的基因，增强它们识别和攻击癌细胞的能力。此外，还有一些研究在探索如何减少或避免免疫治疗的副作用，例如研发更加个体化的治疗方案、开发新的免疫抑制剂等。

总之，免疫治疗是一个具有潜力的肿瘤治疗领域，不断有新的治疗方法和技术问世。虽然免疫治疗面临一些挑战和限制，但是相信通过不断地研究和探索，免疫治疗将会成为未来治疗癌症的重要手段之一同时，免疫治疗也需要大规模的临床试验来证明其疗效和安全性，并为临床实践提供实证依据。此外，免疫治疗需要和传统治疗方法相互补充，形成多学科、多种疗法的综合治疗方案，以期达到最佳治疗效果。

除了免疫治疗，还有其他的肿瘤治疗方法，如化学治疗、放射治疗、手术治疗等。这些治疗方法在不同程度上也存在着一些不足，如化疗和放疗的毒副作用大、手术创伤大等。相比之下，免疫治疗更加注重患者的免疫稳定性和安全性，因此受到越来越多人的关注。

在未来，基于免疫治疗的肿瘤治疗将会越来越受到关注，也会有越来越多的研究和开发。同时，免疫治疗也需要更多的投入和支持，以进