ndrg2在小鼠胚胎及出生后脑组织神经发生区的表达特点

Ndrg2在小鼠胚胎及出生后脑组织神经发生区的研究生： 师：教授（医师 缩略语 中 英 文献回 实验一Ndrg2在胚胎鼠脑组织神经发生区的空间定 主要材 实验方 实验二Ndrg2在出生后小鼠脑组织神经发生区的空间定 主要材 实验方 参考文 个人简历研究成 --CentralnervousInsitud天HCerebralSpinalSuperior root Cortical ExternalgerminallayerofthePurkinjecelllayer theglialfibrillaryacidicintraperitonealneuralstemstandardsalineneuroepithelialstemcellneuraltube胚胎（天数mantlecorpusNdrg2在小鼠胚胎及出生后脑组织神经发生区： 师：教第四西京医院神经内科，西安 Ndrg2是本课题组用消减杂交法从人脑内克隆得到的一个抑癌，它定位于14q11.2，mRNA全长2024bp，编码357个氨基酸，分子量约43KD的蛋白质，1999Ndrg2375个氨基酸残基。Ndrg2定位于细胞胞浆，也定位于胞核。我们以往的研究育和分化增殖调控相关的重要细胞增殖分化相关的。神经发生同样也育相关，我们推测NDRG2是否也与脑发育相关。潜能的神体细胞即神经干细胞。神经干细胞增殖、存活和分化的过程称为经元和神经胶质细胞[2]。哺乳动物中枢神经系统神经干细胞比较集中的一个重要区域是室管膜前下区(anteriorsubventricular(subventricularzone，SVZ)[3,4]。SVZa来源的NSCs不仅具备所有神经干细胞的共性，而其他来源神经干细胞的主要特征。已经有Ndrg2在胚胎及出生后许多组织有较高的表达，在脑组织表达较高。但是就胚胎和出生后脑组织Ndrg2的分布研究的作用，进一步探讨Ndrg2在胚胎神经系统发生和发育过 10.5d1.5d12.5d,14.5d16.5d，18.5d,P0，P7，P14，adultRNA原位杂交[7]，通过检测胚胎组织中mRNA的存在状况来观察的表达。我们利用Ndrg2在侧脑室VZ、SVZ、DCX,GFAP进行双标。结合激光共聚焦显微镜观察、图像分析及统计学分析等,Ndrg2SVZa神经干细胞喙侧迁移流通Ndrg2的分布表达情况。一、Ndrg2E10.5d后小鼠胚胎各个组织形成分化原基，细胞快速增殖，即出Ndrg2中枢神经系统最初的三个脑泡以及分化后的端脑、间脑、后脑均有所表皮细胞内，继而随着上述的迁移过程，相继表达于边缘层，Ndrg2在皮层的表同的表达从向浅层迁移。从E14.5天到E16.5天(图D,E)在VZ，SVZ,CP保持高表达，而在其他各层表达较低。这种表达模式在P0P7没有改变。Ndrg2在脑室层细胞的分布，E11.5天的脑室Ki67、Nestin在脑室层的双标。Ndrg2为绿色伪彩，BrdU、Ki67、Nestin为红VZNestinVZ层内侧，有较多的双标细Ndrg2VZ的神二、Ndrg2VZ，状回的亚颗粒层(subgranularzone，SGZ)都表达Ndrg2较强的信号。提示采用上述原位杂交结合免疫荧光BrdU、DCX、GFAP标记技术分析结RMSNdrg2/BrdU强双标信号。在海马齿状回的颗粒下SVZ、SGZ、RMSNdrg2/GFAP双标较三、Ndrg2Ndrg2E11.5-E18.5在管的室管膜层有强表达。Ndrg2的表达主要在脊髓的腹侧有表达强的信号，背VZVZ的腹侧高表达。BrdU染色细胞的数量在背（MCL，胞层(PCL)、内颗粒层(IGL)。外颗粒层分化、迁移穿过分子层、野细胞层形成内颗粒层(GoldowitzandHamre,1998)[9]。Ndrg27、14天（P7、P14）在野细胞层有强的信号，同时在P14在分子层、内颗粒层可见Ndrg2Ndrg2膜发育，Ndrg2局限于神经节细胞层，外层表达渐弱。ONB产生视网膜各类细胞，处于增殖期，BrdU在这一层标记。在视网膜外层有少数细胞双标。达，所以Ndrg2主要在有 后神经元表达管膜区（VZ）区强表达。主要在VZ层的神体细胞集中。Ndrg2PCLINB有强表达，脊髓腹侧表达。在大脑皮层中等表达，这些部位是有丝后神经元分化的部位。说明Ndrg2在有丝后及成熟神经元有表达。ExpressionpatternsofNdrg2indeveloandadultmousebrainandidateformaster:LijuanLiuXi’an710032,Ndrg2isamemberoftheN-mycdownstream-regulatedgene(NDRG)family.Thusfar,thefull-lengthcDNAofNdrg2encodes2differentproteinvariantsof371aa(41kDa)and357aa,respectively.Itisacytosmicproteininvolvedincelldifferentiation,developmentandapoptosis(Yaoetal.,2008)(Choietal.,2003).Atembryonicday9.5(E9.5),Ndrg2mRNAwasalreadydetectedinthebrainbyNorthernblot(OkudaandKondoh,1999).Inembryos,however,thedetaileddistributionofNDRG2expressionsitesandthefunctionoftheNdrg2remainunclear.Here,inordertodeterminetheroleofNdrg2geneinthemousenervoussystem,wepreformedinsituhybridization(ISH)andimmunocytochemistryonmiceagedE10.5,E11.5,E12.5,E14.5,E16.5,E18.5,P0,P7,P14,adulttostudytheexpressionoftheNdrg2throughmouseembryogenesisandintoadulthood.OurISHresultsshowedthatduringbraindevelopmentNdrg2washighlyexpressedincellsfoundincesrichinneuralprogenitorssuchastheVZ,theSVZandSGZ.InsituhybridizationysisontheembryonicbrainsectionsindicatedthatatRNAlevelsNdrg2ismainlyexpressedinfrontalcortex,DT(dorsalthalamus),ganglioniceminenceandmedulla,particularlyintheventricularzones.However,nocleardataareontheexpressionof inproliferatingprecursorcellsoftheToaddressthesequestionsweexaminedNdrg2mRNAexpressioninproliferatingprecursorcellsoftheSVZbyusingadoublelabelingprocedure,combininginsituhybridizationforNdrg2mRNAwithimmunohistochemistryforbromodeoxyuridine(BrdU),Ki67andNestin,amarkerforproliferatingprecursorcells.FurtherphenotypicstudiesofNdrg2expressingcellsrevealedthatintheSVZthemajorityofNdrg2-positivecellsexpressglialfibrillaryacidprotein(GFAP),andalsocolocalizewithcellsexpressingdoublecortin,amarkerofdifferentiatingandmigratingneuroblasts.OurresultsdemonstratethatNdrg2isexpressedinneuralprogenitorcells,whichsuggeststhatNdrg2mightyanimportantroleinthedevelopmentofmurinecentralnervoussystem.WefurtherinvestigatedtheexpressionpatternofNdrg2inthedeveloembryonicbrain.Ndrg2mRNAsignalswerefoundinearlytheembryosofthemajorityofneuroepithelialcells(Fig.1AforE11.5).TheexaminationofthehybridizationsignalswiththeantisenseNdrg2riboprobeshowsawidespreadexpression(Fig1A).Ndrg2ishighlyexpressedinregionsofactiveneurogenesisinthedevelobrain.Throughoutthestudy,adjacentsectionswerehybridizedwithboththesenseandantisenseprobestoconfirmthespecificityofNdrg2mRNAhybridizationsignals.Nosignalwasobservedinsectionshybridizedwiththesenseprobe(Fig.1BforE11.5,notshownforotherages).AtE14.5,theexpressionwasgenerallymoreintensethanthepreviousagesthroughoutthecentralandperipheralnervoussystem,Interestingly,byE14.5,Alargenumberofcellswereshowingstrongpositivereactionforthegeneintheneopallialcortex,whichiscomposedofaninnerbroadnuclearlayer(corticalte),withanarrowouterrelativelyannuclearlayer(marginalzone;Fig.2E)thedifferentialexpressioninthecortexshiftsfromthedeeplayers(SVZandVZ)totheupperlayers(CPandMZ).StrongexpressioncanbeseeninCP,moderateexpressioninMintermediatezone(IZ)andlowexresssioninthesubte(SP)(Fig.2E)AnimportantfindingofourstudyisthedemonstrationoftheenrichedNdrg2expressioninthesubventricularzoneoftheanteriorlalventricle(SVZa),therostralmigratorystreamandtheolfactorybulb.Ndrg2isexpressedincloseproximitytothesubgranularzone(SGZ),ourfindingshavesuggestedtheexistenceinthesubventricularzone(SVZ)fromsaggittalsectionsofadultratbrainofatrophicmechanism,mediatedbyNdrg2.ToaddressthesequestionsweexaminedNdrg2mRNAinproliferatingprecursorcellsoftheSVZbyusingadouble-labelingprocedure,DoubleimmunfluorescencecharacterizationofNdrg2expressingcellsinadultneurogenicregions(byconfocalmicroscopy).ObservationsathigherpowerrevealedthatthelocalizationofNdrg2mRNAsignalinthedentategyruswasrestrictedtotheinnermostlayerofthegranularcelllayerofthedentategyrusandpyramidalcelllayerofCA1-CA3.Ndrg2mRNAwasalsopresentinmanynon-neuraltissues.Ndrg2expressionwasrestrictedtoaventralregionoftheventricularzonefromE11.5(Fig.5A).Ndrg2expressionwasdetectedweaklyinscatteredcellsintheventralspinalcordatP0.AtP7,cellsintheventralgreyhornstronglyexpressedNdrg2mRNA.Ndrg2expressioninthecerebellaranlagenandependymallayeroftheIVthventricleinaE14.5mouse.AtE16.5,mycolleagueandIshowedthatNdrg2ishighlyexpressedintheretinalganglioncelllayerofthedeveloretina.Ndrg2transcriptsweredetectedinthedeveloCNS,suchasthe --mesencephalicvesicle,ventricle(IVV),epithalamus(ET),thedorsalthalamus(DT)andspinalcord.StrongexpressioncanbeseeninCP.Ndrg2expressioninthesubventricularzoneoftheanteriorlalventricle(SVZa),therostralmigratorystreamandtheolfactorybulb.Ndrg2isexpressedincloseproximitytothesubgranularzone(SGZ).WefoundthatstrongNdrg2expressionlevelwasalsoobservedinthepostmitoticneuronsinpostnatalcerebellumandembryonicretinaandspinalcord.：Geneexpression;Mouseembryos;Neurogenesis;N-mycdownstream-regulatedgene;Insituhybridization-- 14q12.1d我们以往的研究主要集中在Ndrg2是一个抑制癌候选，目前研究表明Ndrg2是一种与细胞生长发育和分化增值调控相关的重要。近年来研究表明在胚胎早期神经管神经上皮中存在大量能够增值分化的多潜能的神体(subgranularZone，SGZ)和脑室下区(subventricularzone，SVZ)。SVZaNSCs不仅具备所有神经干细化为成神经元，成为嗅脑球中间神经元终生更新的来源，这也是SVZa神Ndrg2作为一个新克隆的，对其功能的研究存在许多。在此之前的研究表明，Ndrg2Ndrg2基因可能是一个新的抑癌或抑癌相关。但是Ndrg2在脑组织具体定位及与对神经发生的作用没有具体的研究。所以本研究的目的与意义是探讨Ndrg2在脑组织中的空间定位及对神体细胞的作用，确定Ndrg2的新功Ndrg2是否在神经前体细胞有表达，参与神体细胞的增殖和分化。环节。神经管关闭的整个过程又称为神经胚形成（nuultin）,对神经胚形成的细胞、组织、特别是分子机制的研究是今年发育神经生物学的一个热点领域众多遗传或环境因素的改变均可导致包括神经管缺陷nultubedft,在内统nrlnvous S是成S的性畸形[]神经管缺陷ultubede，)发生率比较高的类型，包括脊柱裂Spinabii、无脑(nnphl、脑、卷尾ulyti或等常见畸D（nultueS发（板oil构成，在神经管形成后神经上皮逐渐演变为假复层柱状上皮；神经上皮细胞具有活跃的分化能力，存在着大量能够增值分化成为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞的特定的神体细胞即神经干细胞[].既转胸dU标记等方法对神经上皮中有增值能力的细胞的分布进行了观察，但资料不能全面反映出发育的神经上皮细胞的全貌。Mkay等[]，鉴定出一种神经元中间丝蛋白命名为巢蛋白(nstin，其表达始于神经胚形成的阶段。目前，Nestin成为早期原始神体细胞的标志物被广泛地应用于神经干发育中的脊椎动物胚胎的神经管由内层的增殖细胞层、VZ丝后细胞层。当神体细胞在VZ层增殖、分化为不同的神经元和胶质细胞。CNS中存在两个传统的神经发生区。即位于侧脑室壁的脑SGZ皮质及脊髓等部位.这些部位的NSC在体内大多处于静止状态。在脑组织受到（neuralstemcells，NSCs）的研究使人们相信，包括人类自身在内的哺乳动物CNS1989NSCs的概念能够长CNSCNS内也存在。在胚胎期，由神CNSSVZ和海马的颗粒下层(subgranularzone，SGZ)NSCs区，因为具有NSCs存活的微环境。SVZ的NSCs沿嘴侧迁移路径迁移至马齿状回、嗅球、终生具有NSCs[19]，发育中人胎脑的室下区、海马、纹状体在神经干细胞分化相关的中，numb的作用特别引人注目。对numb进行的研究表明，numb是参与神经系统的非对称性的一个重要分子，也是构成notch信号传导路的重要成员。numb的缺失或过度表达，4诱导内源性神经干细胞分化修复神经损伤在正常成年侧脑室的室主要脑区：侧脑室外侧壁的室下区(subventricularzone，SVZ)和海马齿状回2周，BrduSVZ层，海马有研究显示，脑缺血时激活大脑皮层的神经发生，NDRG2表达增高Jin在AD患者和AD转（PDGF-APPSw，Ind）小鼠模型中再现了海马齿SVZ神经发生增加的结果。AD患者和动物模型神经发生增加，新生的疾病中丢失的神经元的代偿性反应，通过进一步增强神经发生用于治疗AD[27,28,29,30]。同时，有研究表明，病(HD)的人脑侧脑室室下区细胞的增化环境信号，促进NSC在中枢神经系统损伤后能自我修复。皮质发育(malformationsofcorticaldevelopment,MCDs)是难治性癫痫的常见病因之一。MCDs的致痫机制仍未完全阐明。近年来的一些研究显示，SVZ区s的异常迁移与MCDs的致病机制或者致痫过程密切相关。s神提细胞(neuralprecusorcells，s)的异位迁移和发育异常可能也是癫痫发生的重要原因之一。Parent等研究发现，癫痫发作或者痫样放电可诱导成熟啮齿类动物海马齿状回内的神经发生[31]。大量的研究证实，齿状回中s来胎发育过，由单个全能干细胞发育成具有三维结构和形态的多细胞生物是调控的细胞增殖、生长、迁移。分化或的过程[33]。1970年代Pierce.etal提出“癌,一个发育生物学问题”的理论为研究肿瘤开拓了一个新的科学思维胚胎处理起来比斑马鱼、鸡胚、线虫和非洲得多，但是人类与小鼠细胞分化类型，在早期胚胎发育中，组在卵期甲基化水平较高，囊胚发育和肿瘤形成过存在广泛组的去甲基化，同时甲基化酶DNA甲基化转移酶的水平均呈现出比较高的状态。Rb是最早发现的抑制癌；最近有，在胚胎组织Rb与胚胎滋养层细胞的增殖分化相关，Rb的失活可以导致胚胎滋养层细胞过度增殖，进而使胚胎发育中断；c-myc是癌基因的重要成员，可引起细胞增殖，而且抑制细胞分化，在多种肿瘤组织可见高表达。c-myc在小鼠细胞、细胞及胚胎发育细胞至桑椹胚期均高表达，并与这些时期细胞的指数分化相关。研究发现许多肿瘤相关对胚胎因被破坏导致异常分化，从而导致肿瘤发生。这些调控是影响分化方向的某些与肿瘤有关的是高表达的，肿瘤细胞有胚胎性的表达[34,35,36]。NDRG其人第1外显子的上游含有一个类似于鼠NDRG1N-myc结合区域的GCTATA的增强子[48]。NDRG2357,371两个氨基酸。NDRG3375个氨基酸。NDRG4有三个亚型，NDRG4-B、NDRG4-B、NDRG4-H.分别编码了339、352和371个氨基酸[37,38]。尽管NDRG之间同源性很高，但是组织分布各有不同。Ndrg1主要在心脏、肾脏、胎盘、肺组织、脑组织和骨骼肌[39]；Ndrg2Ndrg4主要在脑组织和心脏中表达最强；前期实验证明，Ndrg2在人中枢神经系统广泛表在神经元区表达最强。Qu等用C末端融合,生物信息学分析，Ndrg2有不a/β水解酶折叠、NF-KB结合位点、脂蛋白脂结合位点。Ndrg2蛋白具有一定的酶活性，可能参与细胞抗氧化应与许多，同时，Ndrg2的表达量是一个动态的过程，在发育的早期阶段表NDRG2也有明显的表达，特别在脑组织和心脏，结果显示NDRG2在组织发生和发生中起Ndrg2蛋白不同程度的表达。Ndrg2mRNA在正常胎脑各脑区均有表达,随脑组织发育成熟，Ndrg2表达水平增高，以上结果表明，Ndrg2在不同脑功能Ndrg2在中枢神经系统的大脑皮质、白质和神经核高表达，在唾液腺上皮细胞和骨骼肌细胞高表达。而在结肠癌、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和腮胞中有较高水平的表达，是多种肿瘤及相应正常组织细胞的差异表达。随着人类组的完成，对其中新结构和功能的确定与研究已成为摆在Ndrg2Ndrg4碱基序列有一定相关性，但是在组织中的表达却有明显的差异。Ndrg2mRNAAlzheimer氏Ndrg4AD中是表达降低的。在一些肿瘤细胞系及显著下降，与同一的正常邻近组织相比，Ndrg2的表达水平在高风险腺瘤细胞轴突的生长[46]Ndrg4PC12[47]，明显抑制轴突的生长。对和乳腺研究发现，Ndrg2能促进上皮组织的正常分化及Choi等[50]研究发现 分布在骨骼肌、唾液腺、脑、肾和肝脏[58]Ndrg2在中枢神经系统广泛表达。激酶（CDK）和细胞周期素（cyclins）结合才使细胞周期正常运行，G1→S和G2→M的转变。Ndrg2的功能研究还处于起步阶段。组织分布研究显示，Ndrg2不仅肝与肝癌[48]、结肠与结肠癌、正常淋组织和淋巴瘤细胞、正常关节滑膜细胞和恶性增生滑膜细胞的差异表达[49]。因此推测Ndrg2可能是一个新的抑癌候选或抑癌相关。抑癌与原癌一样，都对细胞的生长和分化起调节作用[63]。正常细胞的原癌被激活以后，细胞就发生转化，引起癌变。抑癌具有抑制细胞转化和维持细胞正常生长的作用，这类由于点突变、缺失和甲基化等而失活，从而导致细胞[51]。Ndrg2的失活是否如大多数抑癌一样，与突变有关，迄今为止，尚无Ndrg2突变分析的研究。另外，Ndrg2并不是在所有肿瘤细胞中都具有差异表达的特点，不同肿不同细胞生长的影响，并探讨其可能作用机制，对于揭示该的功能具有十AktPI3K/Akt信号通路被激活。在大脑短暂局部缺血，在局部缺血病灶处，Ndrg2在脑缺血病灶细胞表型表现为星形胶质细胞。Ndrg2mRNA4h24h后达到最大值。用免疫荧光检测，Ndrg2GFAP胶质细胞的标志物有双标。Ndrg224hNdrg2与TUNEL阳性细胞双标，并且凋亡细胞随着Ndrg2阳性细胞增高而增加。结论奋性，药物毒性，离子不平衡、炎症、凋亡等，这些因素导致大脑缺血和在AD发病的有关的目前还未完全了解，我们发现A/B-水解酶折叠Ndrg2RNAAD脑组织中是表达增高的。Ndrg2在以下区域有表达AD的发病，例如皮层，在小脑就很少受到影响。并且达，但是在出生后4中度Ndrg2在新皮质和海马有表达。在AD脑组织中位于14q11.2Ndrg2是与AD发病有关的位于同一条上，Presenilin1位于14q24.3[54,55,56]。况[57]免疫组化合原位杂交双标技术可以在同一张组织中同时检测特定的核在全脑切片的基础上，利用免疫组化和原位杂交双标记技术，建立对于Ndrg2行免疫组化标记[58,59]本文采染技术可以清晰的显示Ndrg2的表达部位及细探索神经元前体细胞的微管相关蛋白Doubleeortin(DCX)在成年大鼠神经DCX免疫阳性细胞。DCX免疫阳性细胞在形态上均呈梭形的胞前体细胞的增殖和迁移。胚胎和成体神体细胞具有相同的分子特征和发育和成体发育过存在着细胞系谱的连续性。 NDRG是近年来发现的一族新，即位于N-myc下游并受其调节的该首先作为N-myC敲除小鼠胚胎中的一个上调被克隆和命Ndrg3和mTDD5及大鼠Bdml。人Ndrg2由本室首先克隆得到，于2000年1月被Genbank收录，登录号为AF159O92，专利号: 但是Ndrg2、Ndrg3和Ndrg4并不受N-myc的调节。该成员氨基酸同肾，肝。已经有Ndrg2在脑组织不同区域中主要定位在胶质细胞，包括大Ndrg2与Ndrg4主要在人和鼠心脏和脑组织表达较高。Ndrg2同时促进PC12细胞，树突状细胞，肠细胞的分化。尽管Ndrg2是肿瘤抑制，Ndrg2在短暂大脑局部缺血病灶处表达是增高的。已经有许多Ndrg2在中枢神经系统具有重要的功能。Ndrg2在成年脑组织中在灰质比白质表达高[75]。Ndrg2在AD中是表达增高的。糖皮质激素在神经发生区脑胶质中增加Ndrg2的表达[60]，但是Ndrg2在抗抑郁治疗中在大脑皮质是表达降低的[61]。我们用原位杂交实验显示在胚胎中枢神经系统Ndrg2在VZ区表达是增高的，这同以往的研究是相符合的。有显示Ndrg2在胚胎E14.5在中枢神经系统VZ区有表达。前期的与Ndrg1、Ndrg3，Ndrg4组成新的分化相关。与细胞的生长有关，其表达 特异性的表达，预示着该可能具有特殊的功能。因此，及早弄清Ndrg2在C5718：001：1合笼，将发现LX70荧光倒置相差显微 Olympus 东方特力科贸中 Invitrogen公 Sigma公氯 陕西舟鼎国公无水乙 陕西舟鼎国公5mol/lNaOHPH7.0，加水至1L后高压灭菌。l01l1S%杂交洗脱液Ⅱ 4%多聚：40g多聚溶解于800mlDEPC饱和的去离子水中，在通风处搅拌，加入100ml10×PBS充分混匀后加NaOH调PH值7.0后定容至1000ml。4度保存。质粒:构建T载体的质粒为PGEM-NDRG2，所有引物均有生工公司合EcoRⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ（TAKARA）tRNA、RTInvitrogen公司T4DNAKitPGEM-T载体，T7与Sp6聚合酶均购于Promega公司，DNAMarker2000西安鼎国生物技术DNA片段回收试剂盒KitPromega公司,地高辛探针标记Kit购于Roche公司。司，1∶200)和兔抗Ki67(Sigma公司，1∶200)为一抗，以兔抗FICT和山按免疫荧光染色常规方法对切片行免疫荧光染色，75%PBS封片。各组均设对照，对照切片不加一抗，其余步骤相同(未设阳性对照)。K购自罗氏公司，DEPCSigma公司，璃匀浆器中，加lmlTrizol充解，室温下充分研磨5min；参照In-vitrogenTrizol试剂()RNA提取步骤进行。将匀浆器转移至1.5mlEppendorf管中，室温静置5min；0.2ml氯仿，充分混匀，120004℃75﹪lml，充分混匀，7500g4℃10min，弃上10mim20μLDEPClμLEppendorf生物紫逆转录（RT应用InvitrogenSuper-ScriptTMFirst-StrandSynthesis系统()进行RNA1μL，OT20lμLl0mmol/LdNTP1μLDEPC10μL，65℃孵育5min，冰浴3min，短暂离心；10×RTbuffer2μL，25mmol/LMgCl24μL，0.1mol/LDTT2μL lμL，200u/μLSuperScriptTMⅢRT1℃3’UTRBlastNdrg2所特有（1AB。Forward5"-ctatctcggtctcgcacagca-310bf2.5μm/L3μL，10pmol/L1μLTaqDNA聚合酶0.25μLcDNA2μL。94℃变性5min9430s，501min，7245s35个循环，72℃℃离心，1600g7min。匀后置冰浴30min。4块板，即含转化质粒的细胞铺抗生素(氨苄)板和空白板(不含抗生素)，空白菌37℃16～在-20℃5min用750μl加的DNAWashBuffer液漂洗，13000rpm离心30s，并重复一2μlDNRG2质粒，-20℃贮A小量酶切质粒DNA,2Sac加去离子水至终体积依次将上述样品加入0.5mlEppendorf管中,充分混匀，稍离心以集中液体,于BDNA形明显分离时，在目的条带的前方挖除较目的条带大些的普通凝胶，片紧⑤300ulXP2洗纯化柱，10000g⑥700ulSPW10000g⑦13000gNdrg2mRNASacⅡSP6RNA(DIGRNALabelingKit，RocheDiagnostics，德国)SacI内切酶线性化a）用T7、SP6使质粒线性化： 10xLa5.0dNTP(2.58.0T7(201.0SP6(201.0La0.51.5l(about300线性化DNA模板(upto2.5g) 12.5l 15l 4.5 0.5 2.50.1M 5.05×transcription 离心(4℃)15BrdUBrdU(Sigma;60mg/kg)，1.5h后断颈处死，聚，4℃固定保存12h，25%蔗糖脱水。冰冻切片机切片12μm。脑切片原位分子杂交(insituhybridization，ISH)步骤如下：A胚胎的分离和处理E10.5-El8.5(embryonicdays)C57小鼠，采用颈椎脱臼法处死，获取250g/L蔗糖处理48h。其中胎鼠、新生鼠脑片厚10μm。蛋白酶10min，增加组织的通透性，降低非特异反应。100μl2μl探针标记液，离心使杂交液沉于管底，将切片放入杂交管中，杂交12-16h。2×SSC15分钟，65C0.5-1.0g/mlRNaseA在2XSSC中 30min.消化未结合的cRNA探在0.2xSSC水浴中 30min洗两移入含Anti-Dig-AP抗体(1：2000)，37℃1小时转入4℃20小时。B原位杂交对照在免疫荧光之前原位杂交需要蛋白酶K处理，如果处理时间过长，超过30min将导致杂交信号渐弱。由于这个原因，蛋白酶K在不同胚胎龄消化的时间不同，在免疫荧光之前，需要做抗原修复，取出片子，50℃烤箱5min，放入0.1MPBS的mailer中，小烧杯中加入抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液PH6.0）,大火计时总5min，倒出mailer管中的PBS,等修复液沸起，加到mailer管中，连同mailer放入烧杯中，最小火2min。放置30min放凉。切片BrdU免疫组化染色切片置于0.5MHCL10min在55℃，然后在PH8.50.1M硼酸中10min，然后再0.1MPBS中洗三次，每次10min。加一抗BrdU(1:200,SantaCruz,California,USA)，过夜；0.1MPBS中洗三次，每次10min；加二抗Biotin-Rat， 孵育；0.1M 中洗三次，每次10min；加三抗Cy3avidin(1:800,Chemicon,Temecula,California,USA)，孵育2h；洗片，封片。anti-nestin(1:200,Chemicon)anti-Ki67(1:200;BDBiosciences)上一抗过夜。二抗是biotinylated donkeyanti-rabbit/mouselgGantibody(1:200;Vectorlaboratories,USA)2h室温孵育。三抗Cy3-conjugatedgoatanti-mouseIgG1:800,Chemicon,Temecula,California,USA2h室温孵育。然后染色切片在共聚焦显微镜下彩图(LSM510Meta;CarlZEISSCo.,Germany)。V3.0（UniversityofTexasHealthScienceCenterinSanAntonio，USA）软件提取各表达区域信号的灰度值，扣除自身背景和相应区域的，正义探针灰度实验二Ndrg2在E10.5后，Ndrg2mRNA信号在早期胚胎发育中的前脑、中脑、后脑及Ndrg2的空间分布及在传统的神经发生区Ndrg2的时空表达情况。8h再腹膜内注射一次，2h后用4%多聚灌注小鼠，取出生后小鼠脑组织，试剂在免疫荧光之前，需要做抗原修复，取出片子，50℃烤箱5min，放入0.1MPBS的mailer中，小烧杯中加入抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液PH6.0）,5minmailerPBS,mailer管中，mailer2min30minBrdU然后再0.1MPBS中洗三次，每次10min。加一抗BrdU(1:200,SantaCruz,California,USA)，过夜；0.1MPBS中洗三次，每次10min；加二抗Biotin-Rat， 孵育；0.1M 中洗三次，每次10min；加三抗Cy3avidin(1:800,Chemicon,Temecula,California,USA)，孵育2h；洗片，封片。anti-GFAP1:1000,AccurateChemical&ScientificCorpWestbury,NY)，anti-DCX(1:500,SantaCruzBiotechnology)biotinylateddonkeyanti-rabbit/mouselgGantibody(1:200;Vectorlaboratories,USA)2h室温孵育。三抗Cy3-conjugatedgoatanti-mouseIgG(1:800,Chemicon,Temecula,California,USA)2h室温孵育。然后染色切片在共聚焦显微镜下彩图(LSM510Meta;CarlZEISSCo.,Germany)。V3.0（UniversityofTexasHealthScienceCenterinSanAntonio，USA）软件提取各表达区域信号的灰度值，扣除自身背景和相应区域的，正义探针灰度 Ndrg2本实验取0小鼠脑组织皮层总RNA-R扩增Ndrg2图1A。常规方法转化，碱裂解法大量抽提，经双酶切后得到线性化的目的片段，采用tRTI图1C,Dk2Ndgr22A、B、D为冠状位切片，C、E为矢状位切片。D、E为对照。A所示E10.5d后小鼠胚胎各个组织形成分化原基，细胞快速增殖，即出现Ndrg2中枢神经系统最初的三个脑泡以及分化后的端NDRG2的表达在胚胎发育的早期就出现在室管膜层的神经管上皮细胞内，继而随着上述的迁移过程，相继表达于边缘层，Ndrg2在皮层的表达出现动态变化。NDRG2VZ10.5天，Ndrg2VZ有表达(3A)，E11.5NDRG210.5(3B).E12.5天，NDRG2VZ保持逐渐增厚，NDRG2不同的表达从向浅层迁移。从E14.5天到E16.5天(图天(3F)VZ,SVZ保持高表达，而在其他各层表达较低。这种表达模式在细胞有高表达（4P0，Ndrg2SVZ,SGZ有表达。在5在P14，Ndrg2在小脑野野细胞层及内颗粒层有强的表达。在成年期，在SVZ,SGZ,CA1-CA3RMS迁移流,嗅球有52D,ESGZ,RMSNdrg2/BrdU，Ndrg2/DCX，Ndrg2/GFAP的双标细胞（5。CL，化、迁移穿过分子层、野细胞层形成内颗粒层。所以EGL是产生小脑颗粒主要在野细胞层有强的信号。箭头所示在野细胞层仅有少数双标细胞(6C’)E11.5Ndrg216.5天的视网膜Ndrg2局限于神经节细胞层，外层表达较弱。箭头所示在外层有少数细胞双标(6F’)。Ndrg2E12.5VZ的背部低表达，而在VZ的腹侧高表达。BrdU染色细胞的数量在背侧区域比腹侧明显多。Ndrg2在要在有丝后神经元表达。箭头所示在腹侧有少数细胞双标(图6I’)。Ndrg2Ndrg2在大脑皮层随着脑发育，在侧脑室内侧逐渐向大脑皮层迁移。在E14.5dNdrg2在大脑皮层阳性信号最强。表达。在出生后侧脑室室管膜层，海马齿状回及颗粒下层,RMSNdrg2Ndrg2/BrdU，Ndrg2/DCX,Ndrg2/GFAPSVZ,SGZ有双标细胞（5Ndrg2强的表达，BrdUP7小脑的外颗粒层(6)E16.5d视网膜的外成神经细胞 神经节和脊神经节形成。总之，E8.5-10.5d这段时期主要的原基已经分化。但是，在发育过还有很多没有解决的问题，而揭示这些问题，都将有立中枢神经系统（centralnervous CNS才能得以正常发育；否则将出现神经管缺陷（neuraltubedefect，NTD）表中多种细胞的分化、增殖和凋亡。Ndrg2在胚胎神经组织的表达，尤其是神经管头段（脑区）Ndrg2有可能参与了这个时期神经本实验采用冰冻切片原位杂交技术，观察目的Ndrg2的表达、分布等E10.5-E18.5d，神经胚形成过Ndrg2表达情况，在E10.5d神经沟闭合成神经管，在整个小鼠胚胎有表达。E11.5dNdrg2强的E10.5-E18.5.Ndrg2Ndrg2在神技术。Ndrg2在胚胎神经组织的表达，尤其是神经管头段包括前脑、中脑、后Ndrg2可能参与了这个时期神经管的关闭以及神经管头段的发育，可能在早期胚胎发育过维持神体细胞的未分化Notch信号在神经系统的发育时空表达是相一致的，以后进一步的Ndrg2Notch的关系。我们用原位杂交方法研究发现在脑Ndrg2Northernblot方法的实验揭示了Ndrg2在4、5个月小脑发育过表达的特点，Ndrg2在小脑中均有不同程度表达，并随着脑发育的成熟表达显著，说明Ndrg2Ndrg2与神经细胞Ndrg2对神经系统影响提供了初步信息。在目前的研究中，我们利用原位杂交和免疫荧光双标技术显示Ndrg2主要海马SGZ层，这些结果显示Ndrg2作为一个抑癌，可能在神经发生中起重发现Ndrg2在 体细胞及分化神经元有强表达。在出生后小鼠探索Ndrg2在神经干细胞可能的功能，我们提出在神经发生中Ndrg2可作为抑癌，已经有Ndrg2可以抑制增殖，促进分化，诱导肿瘤细胞凋亡[69,70,71],Ndrg2的强表达在神经发生区域说明神经干细胞的增殖中起到抑制作用。另外Ndrg2在神 SGZ，Ndrg2与GFAP双标细胞在脑组织其他区域很少观察到。因此，就细胞分布，已经有Ndrg2免疫组化染色表明Ndrg2在胶质细胞表达。我们的研究发育分化非常近似，因此作为抑癌的Ndrg2在其中其重要作用。上述很多Ndrg2表达具有时空模式，有显著改变。Ndrg2作为转录激活子参分化成熟和形成，Ndrg2表达是增加的。随胚胎各组织发育成熟后，Ndrg2作用Ndrg2在发育分化中的作用加深对胚胎发育的认识，为胚胎畸形的预防及肿瘤的治疗提供新的。地高辛配基标记ISH方法已被应用于 在有丝元神经元也表达。本研究将为下一步Ndrg2在脑发育中的功能研究BottaiD,FioccoR,GelainF,etal.Neuralstemcellsintheadultnervoussystem.JHematotherStemCellRes,2003;12(6):655-670.KippinTE,CainSW,MasumZ,etal.Neuralstemcellsshowbidirectionalexperience-dependentsticityintheperinatalmlianbrain.JNDianaL.Clarke,GeneralizedPotentialofAdultNeuralStemCells.2JUNE2000vol288,Scinece.RobertJ.Expressionofbonemorphogeneticproteins(BMP),BMPreceptors,andBMPassociatedproteinsinhumantrabecularmeshworkandopticnerveheadcellsandtissues.MolecularVision2002;8:241-50.Yang,H.etal,ThemigrationanddifferentiationofneuronrestrictedprecursorsfollowingtransntationintotheCNS.SocNeurosciAbst,1999;25:215.LiuZR,ShiM,HuZL,ZhengMH,DuF,ZhaoG,DingYQ(2010)Arefinedmapofearlygeneexpressioninthedorsalrhombomere1ofmouseembryos.BrainResBull82:74-82.HuXL,LiuXP,DengYC,LinSX,WuL,ZhangJ,WangLF,WangXB,LiX,ShenL,ZhangYQ,YaoLB.ExpressionysisoftheNDRG2geneinmouseembryonicandadulttissues.CellTissueRes.2006;325(1):67-76LikeinHumanBrainandExpressionItinE.coli[J]，Sheng-wuHuaxueYuShengwuWuliJinzhan(ProgressinBiochemistryandBioRichardLJ,KilpatrickTJ,BartlettPF.Denovogenerationofneuronalcellsfromthedadultmousebrain.ProcNatlAcadSciUSA1992;89(18):8591-5ReynoldsBA，WeissS.GenerationofneuronsandastroeytesfromIsolatedcellsoftheadultmamamaliancentralnervoussystem.Science.1992;255:1707-AndreaD.etal,RegulationofSkeletalProgenitorDifferentiationbytheBMPandRetinoidSignalingPathways.TheJournalofCellBiology,Volume148,Number4,February21,2000679–690WangL，HuH，ZhangC，etal.Isolation，cultivationandidentifieationofneuralstemcellfromhumanembryonicCNS.ShengWuYiXueGongChengReynoldsBA，TatzlaffW，WeIssS.AmultiPotentEGF-responsivestriatalEmbryonicProgenitorcellProdueesneuronsandastrocytesJNeurosci1992;PenceaV,LuskinMB.Prenataldevelopmentoftherodentrostralmigratorystream.JCompNeurol,2003;463(4):402-18.ShenL,ZhaoZY,WangYZ,JiSP,LiuXP,LiuXW,CheHL,LinW,X,ZhangJ,YaoLB(2008)ImmunohistochemicaldetectionofNdrg2inthemousenervoussystem.Neuroreport19:927-931.theembryonichumanbrain.ChJContemppediatr2003;5(4):311-ErikssonPS，PerfilievaE,Bjork-ErikssonT,etalNeurogenesisintheadulthumanhippocampusNatMed1998:4(3):1313-7transtionofPurifiedO-2AProgenitorcells.Nature1993，362(6419):453-5 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