细菌的培养方法

实验三、细菌接种及分离培养；自然界及正常人体的细菌检查

昆明学院医学院病原生物学教研室

当前1页，总共31页。教学目标1.熟悉常用的纯种细菌的接种方法。2.掌握标本中细菌的分离培养技术。3.了解细菌广泛分布于自然界及正常人体，树立“有菌观念”。4.深刻认识“无菌操作”对于微生物实验及医药学实践的重要性。5．进一步理解“正常菌群”的概念。当前2页，总共31页。实验主要内容1．录相：细菌的培养方法2．操作：⑴空气中细菌的检查（沉降法血平板1块/6人）⑵呼吸道细菌的检查（咽拭子法培养血平板1块/3人）⑶随身物品的细菌检查（手指消毒前后普通平板1块/3人）⑷细菌的接种法（液体、半固体、固体1套/3人）材料：⑴大肠埃希菌培养物（1支/6人）⑵碘酒、75%酒精、棉签等（1套/6人）当前3页，总共31页。培养基的制备一、培养基（culturemedium）由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。当前4页，总共31页。（一）培养基的类型及应用1、按用途划分1）基础培养基

能满足一般细菌生长繁殖的营养需要，如肉汤（包括牛肉膏、蛋白胨、氯化钠等）。2）营养培养基

在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏等。当前5页，总共31页。3）鉴别培养基4）选择培养基

用于鉴别不同类型细菌的培养基。特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种细菌与其他细菌区分开来。

将某种细菌从混杂的细菌群体中分离出来的培养基。根据不同种类细菌的特殊营养需求，在培养基中加入相应的特殊营养物质；或者加入某些化学物质，抑制不需要的细菌生长，有利于所需细菌的生长。5）厌氧培养基当前6页，总共31页。SS琼脂培养基（Salmonella-Shigellaagar）

大肠埃希菌沙门菌志贺菌当前7页，总共31页。2、根据物理状态划分

液体培养基：增菌固体培养基（琼脂浓度为2－3％）：增菌，分离培养半固体培养基（琼脂浓度为0.2-0.5%）：动力检查，保种液体培养基固体培养基半固体培养基当前8页，总共31页。（二）细菌生长繁殖的条件1．充足的营养物质；2．适宜的温度；3．合适的酸碱度（ph）；4．必要的气体环境；当前9页，总共31页。温度嗜冷菌

(10-15℃)嗜温菌（30-40℃）：绝大多数病原菌嗜热菌（50-85℃）当前10页，总共31页。

pH嗜中性菌（5to8）嗜酸性菌（below5.5）嗜碱性菌（above8.5）多数病原菌最适酸碱度为PH7.2-7.6霍乱弧菌耐碱PH8.4-9.2结核分支杆菌耐酸PH6.5-6.8当前11页，总共31页。气体环境氧和二氧化碳按细菌对氧的需求可分为四种类型：（1）专性需氧菌（obligateaerobe,O2>20%）（2）兼性厌氧菌（facultativeanaerobe,O2:Yesorno）（3）微需氧菌（microaerophilicbacterium,O2:2~10%）（4）专性厌氧菌（obligateanaerobe,O2:No）某些细菌如奈瑟菌在培养时需要提供5-10%二氧化碳；当前12页，总共31页。二、细菌在培养基中的生长现象1．固体培养单个微生物在适宜的固体培养基表面生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的有一定形态结构的细菌集团，称为菌落（colony）。菌落特征是鉴别细菌的重要依据之一。当前13页，总共31页。2液体培养表面生长

沉淀生长

混浊生长

当前14页，总共31页。3半固体培养常用于检查细菌动力无动力有动力当前15页，总共31页。本次试验的操作：空气中细菌的检查（沉降法，血平板）呼吸道细菌的检查（咽拭子或咳碟培养，血平板）随身物品细菌检查（普通平板）细菌的接种法：液体、半固体、固体培养基当前16页，总共31页。空气中细菌的检查检查空气中细菌的方法很多，沉降法是其中的一种。它是利用含有细菌的尘粒或气溶胶粒因重力作用而自然下降于培养基表面，通过细菌培养，计数其菌落数，而粗略地进行评估。当前17页，总共31页。

操作：将血平板打开盖，放到教室的四个角上，静止15分钟后，合上盖后送37℃孵箱培养。沉降法简单易行，缺点是不够准确。但它客观地反映了空气污染的程度和卫生通风状况，对手术室、食品业等有重要的参考意义，是判断空气污染的指标之一。当前18页，总共31页。

据推算，每100cm²培养基在空气中暴露5分钟，其表面接受自然沉降的细菌数约相当于10升空气中所含的细菌量。

所以：

每m³空气中活菌数=（100cm²培养基上菌落平均数/30）x1000。当前19页，总共31页。

鼻咽喉及口腔是人体与外界相通的腔道，常常有不同种类的细菌存在。这些细菌常是条件致病菌，在一般情况下并不致病，但是当机体的抵抗下降时，可引起疾病而对机体造成危害。由于寄居人体的关系，这些细菌对营养的要求较高，所以常用含血的培养基进行分离。

鼻咽喉及口腔中细菌的检查

—咳碟试验当前20页，总共31页。方法：（1块／3人）打开血平板，将平板置于口腔前约15cm处，对准培养基表面用力咳嗽3～4次，然后盖好平板盖，放置于37℃孵箱内培养24小时观察结果。当前21页，总共31页。在人体的皮肤表面有多种细菌存在，用水洗手或用肥皂洗手，可以除去皮肤上的污垢和灰尘，从而减少手上细菌的数量，但并不能有效的杀死细菌。而日常医疗、试验工作中常用的化学消毒剂如碘酒、酒精等有很好的杀菌作用，它们不仅对细菌的繁殖体，对芽孢也有一定的杀灭效果，所以在临床医疗中广泛应用。正常人体皮肤及随身物品的细菌检查当前22页，总共31页。1、将平板底部用mark笔划线分成均匀的8个区，分别标记为①②③④⑤⑥⑦⑧。2、用右手的食指在①区上轻轻按一下，然后用肥皂在流水下将手洗干净，用无菌棉签拭干右手食指皮肤上的水，再轻轻在②区培养基上按一下。3、用左手食指轻轻在③区按一下，然后用棉签蘸碘酒消毒左手食指皮肤，待干后轻轻在④区按一下。4、任取随身物品在⑤⑥⑦⑧区各按一下。5、盖好平板，送37℃孵箱培育24小时后观察结果。操作与注意事项（1块／3人）当前23页，总共31页。注意事项：用手指或物品按培养基时，接触面可稍微大一些，但切勿用力，否则，易将培养基压破，影响结果的判断。如果不慎压破，可在临近未破处重新按一下。当前24页，总共31页。三线法分离接种当前25页，总共31页。

细菌的分离接种琼脂平板划线分离接种法（固体培养基）三线法穿刺接种法（半固体培养基）液体培养基接种法

接种时要注意无菌操作，避免污染，防止细菌外溢污染环境。