第十章DNA的合成与修复

本章主要内容一、DNA的半保留复制二、DNA复制的起点与方向三、DNA的半不连续复制四、与DNA复制有关的蛋白质五、大肠杆菌DNA的复制过程六、复制起始的时序控制七、真核生物DNA复制特点八、DNA损伤的修复当前1页，总共67页。

1.掌握遗传信息传递的中心法则。2.

掌握DNA复制的一般规律：DNA的半保留复制、DNA的半不连续复制的概念。3.

了解三种大肠杆菌DNA聚合酶的催化特性及其功用；了解原核生物DNA的复制过程。4.

了解使DNA损伤的因素；DNA损伤的修复机制：错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、直接修复、重组修复及倾向差错的修复的过程及过程所需要的酶类；了解DNA损伤修复的意义。目的要求当前2页，总共67页。1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录

1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。

中心法则：病毒（复制）复制转录DNARNA蛋白质翻译逆转录RNA的复制存在于RNA病毒DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。当前3页，总共67页。

复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。几个基本概念：

逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。

翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。

转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。当前4页，总共67页。Reversetranscription中心法则图示当前5页，总共67页。一、DNA的半保留复制2.半保留复制的实验证据:1.定义：1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。当前6页，总共67页。DNA复制的可能方式全保留与全新复制分散复制半保留复制当前7页，总共67页。DNA半保留复制图示：当前8页，总共67页。半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。当前9页，总共67页。15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度当前10页，总共67页。当前11页，总共67页。亲代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子二代DNA(15N～14N，14N～14N1:1)子三代DNA(15N～14N，14N～14N1:3)子四代DNA(15N～14N，14N～14N1:7)亲代DNA与子二代DNA的混合物亲代DNA与子四代DNA的混合物当前12页，总共67页。复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图当前13页，总共67页。DNA的半保留复制的生物学意义：DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。

DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。当前14页，总共67页。双向复制单向复制二、DNA复制的起点与方向当前15页，总共67页。当前16页，总共67页。复制中的DNA

复制原点复制叉当前17页，总共67页。DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）3不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）当前18页，总共67页。三、DNA复制的半不连续性前导链滞后链冈崎片段前导链：以3’→5’方向的亲代链为模板连续合成的子代链。滞后链：以5’→3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。当前19页，总共67页。半不连续复制的发现

同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬菌体感染的大肠杆菌短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶的缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。→证明DNA复制中有小片段合成。测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。1968日本学者冈崎：当前20页，总共67页。四、与DNA复制有关的酶和蛋白质原料：四种脱氧核苷三磷酸dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH.合成方向：53(一)DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：当前21页，总共67页。（二）大肠杆菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；（3）还具有53’外切酶活性（双链有效）；1、DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。当前22页，总共67页。DNA聚合酶催化的反应：当前23页，总共67页。ⅠDNA聚合酶Ⅰ的功能当前24页，总共67页。ArthurKornberg1918

StanfordUniversity

Stanford,CA,USA

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"当前25页，总共67页。2、DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。当前26页，总共67页。3、DNA聚合酶Ⅲ

多亚基酶，含十种亚基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）称为核心酶，β2称为夹子，（γ2δδ’χΨ）组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。当前27页，总共67页。DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成亚基相对分子量亚基数目基因亚基功能αεθτγδδ’χΨβ1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadX＊holAholBholCholDdnaN聚合作用3’→5’外切酶的校对功能组建核心酶使核心酶二聚化依赖DNA的ATP酶，形成γ复合物与β亚基结合，形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物两个β亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。当前28页，总共67页。DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体前导链的合成滞后链的合成当前29页，总共67页。DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图DNA双螺旋当前30页，总共67页。DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ结构基因＊不同种类的亚基数目相对分子质量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持续合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修复PolB≥788,000＋－2,4001,500修复PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000复制大肠杆菌三种DNA聚合酶比较当前31页，总共67页。(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点：大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。当前32页，总共67页。DNA连接酶作用机理当前33页，总共67页。(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能相对分子量（×103）分子/细胞DNA旋转酶（或拓扑异构酶）DNA解链酶单链结合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松开超螺旋使双链DNA解链稳定单链区合成RNA引物除去引物并填满缺口40065746010950300100300当前34页，总共67页。1、拓扑异构酶拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。当前35页，总共67页。拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。两类拓扑异构酶作用特点:

二者共同控制DNA的拓扑结构。当前36页，总共67页。当前37页，总共67页。2、解螺旋酶（解链酶）

通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。当前38页，总共67页。引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。3、引物合成酶与引发前体引物合成酶：催化引物RNA的生成

引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。当前39页，总共67页。稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。4、单链结合蛋白：当前40页，总共67页。（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图当前41页，总共67页。五、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）复制的终止：复制的起始1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成链的延伸：当前42页，总共67页。复制原点oriC和原点的识别：从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。

DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用oriC(或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π、SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。当前43页，总共67页。（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。当前44页，总共67页。当前45页，总共67页。(二)链的延长（冈崎片段的合成）

真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp当前46页，总共67页。DNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。

前导链滞后链冈崎片段半不连续复制冈崎模型当前47页，总共67页。冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:当前48页，总共67页。前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）当前49页，总共67页。当前50页，总共67页。(三)复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。当前51页，总共67页。大肠杆菌DNA

复制的终止当前52页，总共67页。(四)DNA复制的精确性（高保真复制）1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。3、DNA的损伤修复系统。DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制1000～10000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：当前53页，总共67页。六、复制起始

的时序控制当前54页，总共67页。七、真核生物DNA复制的特点4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp。3、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为1000～3000bp/min(仅为原核生物的1/20～1/50）。当前55页，总共67页。真核DNA复制特点7、RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填补缺口。5、真核生物有多种DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的复制酶，在PCNA存在下有持续的合成能力。PCNA称为增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夹子，RFC蛋白相当于夹子装配器。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由许多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA的逆转录酶.当前56页，总共67页。真核细胞内有五种DNA聚合酶DNA聚合酶αDNA聚合酶β

DNA聚合酶γ

DNA聚合酶δDNA聚合酶ε定位亚基数目外切酶活性引物合成酶活性持续合成能力抑制剂功能细胞核4－＋中等蚜肠霉素引物合成细胞核1－－低双脱氧TTP修复线粒体23’→5’外切酶－高双脱氧TTP线粒体DNA合成细胞核23’→5’外切酶－有PCNA时高蚜肠霉素核DNA合成细胞核＞15’→3’外切酶－高蚜肠霉素修复当前57页，总共67页。真核细胞DNA复制示意图当前58页，总共67页。八、DNA损伤的修复DNA突变：

DNA的核苷酸顺序永久性的改变称为DNA的突变。其主要形式有：

1.点突变：DNA分子中一个碱基对替代另一个碱基对称为点的突变。

2.插入作用：DNA分子中插入一个或几个碱基称为插入作用。

3.缺失作用：

DNA分子中缺失一个或多个碱基对称为缺失作用。DNA在复制时产生错配，病毒基因整合，某些