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文档简介

基因突变指一个基因中的DNA改变,最终造成遗传多样性第一页,共81页。10.1基因突变种类碱基对改变(点突变)转座因子第二页,共81页。10.1.1碱基对改变如果一个基因上原来的一个碱基对被另一个碱基对取代,称为点突变置换(同义突变、错义突变、无义突变)插入或缺失(移码突变)第三页,共81页。1、置换

同义突变错义突变无义突变第四页,共81页。同义突变(samesensemutation)碱基被替换之后,产生了新的密码子,但新旧密码子同义,所编码的氨基酸种类保持不变,因此同义突变并不产生突变效应。第五页,共81页。错义突变(missensemutation)碱基替换使编码某种氨基酸的密码子变成编码另一种氨基酸的密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。第六页,共81页。无义突变(non-sensemutation)碱基替换使编码氨基酸的密码变成终止密码UAA、UAG或UGA。T代替G第七页,共81页。2、插入或缺失移码突变第八页,共81页。根据基因突变发生的原因,可将突变分为:自发突变和诱发突变在自然条件下,未经人工处理而发生的突变为自发突变经人工处理而发生的突变是诱发突变3、突变的诱发第九页,共81页。诱变剂能诱发基因突变的各种内外环境因素统称为诱变剂(mutagen)物理诱变剂:各种射线等化学诱变剂第十页,共81页。紫外线诱发的胸腺嘧啶二聚体T-AT-T第十一页,共81页。常见的化学诱变剂有:碱基类似物:以假乱真如:5-Bu(酮式与T结构相似,烯醇式与G结构相似),可以置换T或G丫啶类染料、氮芥类衍生物:造成DNA增加一、二个碱基,引起移码突变亚硝酸或烷化剂:可以改变核酸中核苷酸化学组成

第十二页,共81页。HNO2第十三页,共81页。10.1.2转座因子第十四页,共81页。麦克林托克在某些玉米籽粒中发现玉米籽粒颜色的遗传很不稳定,有时籽粒上还出现一些斑斑点点。她通过耐心的记录和仔细的分析,发现使籽粒着色的色素基因是在某一特定带上“接上”或“拉断”的。第十五页,共81页。解离因子(Ds,Dissociation)抑制红、紫颜色的产生激活因子(Ac,Activator)

使颜色产生麦克林托克花了6年时间(1944—1950)发现玉米的“Ds-Ac调控系统”第十六页,共81页。1951年,在冷泉港生物学专题讨论会上,麦克林托克递交了自己的学术论文,向科学界同行报告了她的新理论。她提出遗传基因可以转移,能从染色体的一个位置跳到另一个位置,甚至从一条染色体跳到另一条染色体上。她把这种能自发转移的遗传基因称为“转座因子”。

“转座因子”除了具有跳动的特性之外,还具有控制其他其因开闭的作用,因此“转座因子”又可叫做“控制因子”。第十七页,共81页。巴巴拉·麦克林托克的发现,当时几乎不被科学界所接受直到20世纪60年代末,美国细菌学家J.Shapiro夏皮罗在研究大肠杆菌乳糖操纵子时,发现有一类可以移动的因子,会导致基因的插入失活和自主恢复活性,从而确认了转座因子的存在1983年,巴巴拉·麦克林托克荣获诺贝尔生理学和医学奖。第十八页,共81页。转座子可以分为两大类:以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段,重新插入基因组DNA中。第十九页,共81页。根据转座的自主性,这类元件又可以分为自主转座元件和非自主转座元件,前者本身能够编码转座酶而进行转座,后者则需在自主元件存在时方可转座,以玉米的Ac/Ds体系为例:Ac(Activator)属于自主元件,Ds(Dissociation)则是非自主元件,必需在Ac元件存在下才能转座第二十页,共81页。转座插入可引起插入突变、新基因产生及染色体畸变等遗传学效应基因组中DNA转座不仅可用于解释染色体缺失、倒位等遗传现象,而且还可用于构建新的突变株第二十一页,共81页。在几乎所有物种中都发现了与转座子相关的序列如人类中的Alu(阿奴)因子第二十二页,共81页。人的Alu因子约占人基因组10%,由300bp构成基本单位,在每个细胞中约有数十万拷贝Alu因子比绝大多数功能性转座因子短得多,不编码任何蛋白质人的DNA中,由于Alu因子转座插入,可导致血友病和家族性高胆固醇血症等发生一种罕见的人类神经紊乱疾病—腿和脚的肌肉以及神经逐渐退化疾病,是由类似果蝇的转座因子Mariner插入17号染色体所致第二十三页,共81页。10.2脱离正常轨道的细胞—癌细胞第二十四页,共81页。在动物和人体中,由于细胞分裂调节失控而无限增殖的细胞称为肿瘤细胞恶性肿瘤是指具有转移能力的肿瘤细胞离开原来的部位,扩散到新的组织、器官形成的新的肿瘤第二十五页,共81页。癌细胞的主要特征能自身提供充足的生长信号对抑制/抗生长信号不敏感能逃避细胞凋亡有无限复制的潜能能支持癌中新血管生长发生组织侵染和转移第二十六页,共81页。致癌因子

物理化学生物第二十七页,共81页。致癌基因在1911年Rous发现能使鸟类结缔组织长出肿瘤的病毒,按发现者的名字命名,为劳氏肉瘤病毒(RSV,发现者,1879—1970,1966年获诺贝尔奖)在致癌病毒中找到与致癌直接相关的基因,称癌基因,RSV中的癌基因定名为src基因。第二十八页,共81页。src表达产物是酪氨酸激酶,可使细胞中蛋白质的酪氨酸磷酸化,使蛋白质构型和功能改变,从而造成正常细胞癌变进一步研究发现,未感染的寄主细胞中,用分子杂交技术也能找到与病毒癌基因相近的核苷酸序列,称为细胞癌基因(c-src),或原癌基因来自病毒的称病毒癌基因(v-src)第二十九页,共81页。原癌基因如何变成癌基因转座或易位基因扩增点突变造成过度表达,或表达产物蛋白质活性失控,导致细胞发生转化,向癌变方向发展第三十页,共81页。肿瘤抑制基因P53—抑癌基因P53表达产物是与专一性DNA结合的核蛋白P53可通过将细胞阻断于G1期而抑制细胞生长在某些细胞类型中诱发细胞凋亡P53基因是人类肿瘤相关基因中突变频率最高的基因第三十一页,共81页。10.3人类基因组计划(HGP)1986年,美国Dulbecco在《Science》上发表的一篇题为“癌症研究的转折点:人类基因组测序”的短文认为:要弄清癌症的发生、演进、侵袭和转移的机制,必须对人的基因组进行全序列测定;并认为这样大的项目必须通过国际协作共同完成他的建议很快得到科学界的赞同和美国有关部门支持第三十二页,共81页。1990年正式启动,预计15年时间,投资30亿美元。美、英、法、德、日、中六国,我国是唯一的发展中国家,完成1%的测序工作(3号染色体3千万个碱基对)2000年6月公布草图,2003年完成。第三十三页,共81页。1998年5月11日,世界上最大的测序仪生产商美国PEBiosystems公司,以其刚研制成功的300台最新毛细管自动测序仪(ABI3700)和3亿美元资金,成立了CeleraGenomics公司,宣称要在3年内,以所谓的“人类全基因组霰弹法测序策略”完成人类基因组测序,并声称要专利200~400个重要基因,并将所有序列信息保密3个月。Celera公司已有雇员300多人,购买了号称“全球第三”的超大型计算机,号称拥有了超过全球所有序列组装解读力量总和的实力。就在六国共同宣布工作框架图构建完成的同一天,Celera公司宣称已组装出了完整的人类遗传密码。Celera公司此举,是对公益性的HGP的竞争与挑战第三十四页,共81页。基因组(genome):一个生物体的全部基因序列最简单的生物如SV40病毒的基因组仅含有5100碱基对(basepairbp)大肠杆菌基因组的大小为5700千碱基对(kbp)人的基因组则由大约3.0×109个bp组成第三十五页,共81页。人类共有2.5万个基因或更少(原先估计5~10万)是原核生物平均基因数的5~15倍人平均基因长度27000bp,而原核生物基因约1000bp经典分子生物学认为一个基因只能表达一种蛋白质,而人体中存在着非常复杂繁多的蛋白质,提示一个基因可以编码多种蛋白质,蛋白质比基因具有更为重要的意义第三十六页,共81页。人类基因组的构成

第三十七页,共81页。假基因(pseudogene):具有与功能基因相似的序列,但由于有许多突变以致失去了原有的功能,所以假基因是没有功能的基因,常用ψ表示。间隔区是指基因间不编码的部分,间隔区常常含有转录的启动子和其它上游调节序列。内含子是指基因内部不编码的区域,也称间插序列.在初始转录中存在此序列,但在加工后将被切除掉,所以常不作为翻译的信息。有的内含子也可以编码,如成熟酶和内切酶等。第三十八页,共81页。在人类基因组中:外显子仅占1.5%,内含子和调节序列占25%;基因外DNA间隔占74.5%,其中Alu序列就占10%(中度重复序列)第三十九页,共81页。10.4DNA操作技术DNA操作技术是当今分子生物学研究的核心技术基因工程技术是DNA操作技术的一部分第四十页,共81页。基因工程采用类似工程技术的方法,在离体条件下将特定的基因或DNA序列插入载体中,构成重组DNA,再把它导入特定的生物细胞中,使外源基因在其中复制表达,制造出大量基因和基因产物,并改变受体生物的性状。第四十一页,共81页。过程1、目的基因的获得及制取:限制性内切酶2、基因载体的选取:质粒、噬菌体3、DNA体外重组:连接酶4、DNA重组体导入受体细胞:大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌5、重组体的筛选6、重组基因的表达基因工程的内容第四十二页,共81页。基因克隆示意图第四十三页,共81页。10.4.1目的基因的获得及制取第四十四页,共81页。1目的基因获得化学合成法基因组DNA文库cDNA文库聚合酶链式反应PCR第四十五页,共81页。基因组DNA文库

利用分子克隆的方法,可以把某物种的全部DNA切割成大小合适的片段,并重组到合适的载体中,在合适的受体细胞中扩增,于是人们就可以方便的保存该物种的全部DNA称为该物种的基因组文库第四十六页,共81页。cDNA文库如果把某组织或细胞中全部的mRNA变成DNA,再克隆到合适的载体上,就得到cDNA文库。它涵盖了该组织或细胞中表达的全部基因的编码序列第四十七页,共81页。DNA多聚链式反应1985年由美国Millus创立PCR第四十八页,共81页。基因的扩增技术

——链式扩增反应5′3′3′5′5′3′3′5′+变性(94℃)复性(55℃)5′3′P13′5′+P2+P1P2合成(72℃)PCR经60次循环,扩增倍数为109~1010第四十九页,共81页。操作步骤:1、加热变性:将待扩增的DNA置于94~95℃的高温水浴中加热5分钟,使双链DNA解链为单链DNA,分开的两条单链作为扩增的模板。2、退火:将加热变性的单链DNA溶液的温度缓慢下降至55℃,在这过程中将引物的碱基与单链模板DNA一端碱基互补配对。3、延伸:在退火的过程中,当温度下降至72℃时,在耐热性TaqDNA多聚酶、适当的pH和一定的离子强度下,引物碱基和模板DNA结合延伸成双链DNA。第五十页,共81页。

2制取

将所需的基因从DNA上切割下来,所用的“手术刀”--限制性内切酶内切酶是存在于微生物体内具有特异功能的酶类,是微生物作为区别自己与非己的DNA,近而降解非己的DNA分子的一种防卫工具将之提取出来作为基因操作工具。第五十一页,共81页。限制性内切酶特点:种类多极强的特异性,在特定的碱基顺序位点上切开,出现两种末端:粘性末端粘端

平头末端平端第五十二页,共81页。10.4.2基因载体的选取外源基因不易进入宿主细胞,即使进入也难以进行复制和表达,往往会被宿主细胞的内切酶系统降解掉。必须寻找合适的载体,将外源目的基因重组到载体DNA上,组成重组体,再利用载体的生物学特性导入宿主,完成复制和表达。第五十三页,共81页。主要载体为:质粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)不同载体运载外源DNA的大小不同质粒载体一般在15kb以下噬菌体可容纳25kbBAC可达100~500kbYAC可以插入250~2000kb的DNA片段第五十四页,共81页。细菌、酵母菌和放线菌等生物细胞中染色体以外的双链闭合环状分子。大小为1~200kb;能独立于染色体外进行自我复制,每个细胞中可含10~200个拷贝。其表型效应主要有决定抗药性,合成抗菌素,编码限制或修饰酶等染色体质粒质粒载体第五十五页,共81页。理想的质粒

拷贝数多;两三个抗药性基因:terr,ampr作为

筛选标志

合适的限制性内切酶酶切位点第五十六页,共81页。pBR322EcoRⅠHindⅢBamHⅠAvaⅠPvuⅡSalⅠPstⅠOri

EcoRI是从大肠杆菌菌株EcoRRY13中取得的第一种限制酶HindШ是从流感嗜血杆菌中取得的第三种限制酶氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因复制起点第五十七页,共81页。10.4.3DNA体外重组外源基因与载体的连接(DNA连接酶)连接方式:粘性末端连接连接效率高平端连接连接效率低第五十八页,共81页。第五十九页,共81页。第六十页,共81页。重组之后的外源DNA还必须回到细胞内才能复制和表达,显示出生物学活性。基因工程常用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌为受体菌(宿主)10.4.4重组DNA导入受体菌

第六十一页,共81页。细菌质粒常用的受体细胞是大肠杆菌将外源DNA导入细菌的过程称为转化细菌只有在一定状态下,才可接受外源DNA进入细胞,这种状态称为感受态受体细胞,如用氯化钙或用蒸馏水处理后,再加电击,细菌细胞膜会出现暂时性孔洞,成为能允许带有外源DNA的载体进入的感受态细胞重组质粒进入受体细胞的概率仅为1‰第六十二页,共81页。重组质粒转化进入受体细胞后,还需要进行筛选鉴定,以挑出含有正确插入外源基因的重组体克隆,摒弃空的载体克隆10.4.5重组体的筛选第六十三页,共81页。培养基中加抗生素培养抗药性标志选择第六十四页,共81页。蓝白斑筛选由于许多载体的基因组中含有β-半乳糖苷酶基因lacZ,这种载体感染大肠杆菌后,会在大肠杆菌内合成β-半乳糖苷酶IPTG(诱导物)(异丙基硫代--D-半乳糖苷)X-gal(显色剂)(5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷)深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。形成蓝色菌落如果外源基因插入载体的位置阻断了β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列,则见到无色菌落第六十五页,共81页。10.4.6克隆基因的表达表达载体有转录、翻译的元件密码子通用第六十六页,共81页。表达载体必须具备的条件:独立地进行复制具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记具有很强的启动子具有阻遏子具有很强的终止子所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号第六十七页,共81页。大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制缺乏翻译后加工机制,不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体(不溶的、无活性的),复性后才有活性很难表达大量的可溶性蛋白第六十八页,共81页。包含体形成的原因

高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包含体的形成大肠杆菌中缺乏蛋白折叠过程中的酶和辅助因子,如折叠酶和分子伴侣等第六十九页,共81页。包含体形成对于重组蛋白的优势:包含体具有高密度,易于分离纯化抵御大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解对于生产那些天然构像对宿主细胞有毒害作用的蛋白时,是最佳选择第七十页,共81页。10.4.7转基因动物将外源基因导入到动物体内当这种外源基因与动物本身的基因整合后,外源基因就能随细胞的分裂而增殖在动物体内表达出动物原来没有的性状并能传给后代这种动物称为转基因动物第七十一页,共81页。1981年,美国的Brinster和Palmiter用小鼠进行了转基因实验特大鼠生长激素基因与小鼠的金属硫蛋白的基因(MT)连在一起,构成MTrGH基因然后用显微注射法注射到小鼠受精卵中再移植入假孕鼠的子宫中,发育生长共产出21只小鼠其中7只带外源基因,而6只体型较原小鼠大一倍左右即著名的转基因超级小鼠

超级小鼠第七十二页,共81页。转基因动物实验研究方向1、培育抗逆、优质的动物新品种如:抗冻鱼、高瘦肉率猪、高产奶牛等第七十三页,共81页。2、培育生产药用蛋白或医学研究模型的转基因动物就基因药物而言,最理想的的基因表达场所是乳腺,从乳汁中提取的目的基因产物不但产量高且生物活性稳定第七十四页,共81页。携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔”第七十五页,共81页。第七十六页,共81页。什么是“三亲婴儿”?人类的基因有99.8%由父母双方共同提供,但有一小部分线粒体基因完全来自母方。线粒体只经过母婴遗传,如果母方的这部分基因中若存在缺陷(例如身患肌肉萎缩症),就会将其遗传给下一代。而“线粒体替换”疗法能够借助第

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