第四章基因克隆的载体详解演示文稿

第四章基因克隆的载体详解演示文稿当前1页，总共81页。优选第四章基因克隆的载体当前2页，总共81页。

载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：当前3页，总共81页。1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。4、有适合的标记，易于选择。5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。当前4页，总共81页。功能克隆载体:

克隆一个基因或DNA片断表达载体:

用于一个基因的蛋白表达整合载体:

把一个基因插入到染色体组中当前5页，总共81页。来源：

质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体真核细胞克隆载体当前6页，总共81页。质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征当前7页，总共81页。1.质粒（plasmid）载体

质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106～108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。当前8页，总共81页。

质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1～3个抗药性基因，以利于筛选。当前9页，总共81页。质粒载体克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。当前10页，总共81页。1.1质粒的生物学特性：

1、质粒DNA的构型：

SC型共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型开环DNA（ocDNA）L型线性DNA（cDNA）2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：

106～108D

3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：

复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点

当前11页，总共81页。LOCSC当前12页，总共81页。4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。

抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等5、质粒DNA的类型：

接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌素抗性基因的R质粒；F因子和F`因子等。按接合转移功能分类主要基因按抗性记号分类非接合型质粒自主复制基因，长生大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)接合型质粒自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段F质粒（F因子）自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Ent质粒当前13页，总共81页。6、质粒DNA的复制类型：

低拷贝的质粒（1～3）：严紧型复制控制的质粒（接合型）高拷贝的质粒（10~60）：松弛型复制控制的质粒（非接合型）

7、质粒的不亲合性

在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性:是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。当前14页，总共81页。当前15页，总共81页。1.2质粒DNA的分离与纯化

1、氯化铯密度梯度离心法2、碱变性法

当前16页，总共81页。1.2.1氯化铯密度梯度离心法1、质粒DNA占总DNA的1%～2%；2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。当前17页，总共81页。流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去。在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。

当前18页，总共81页。当前19页，总共81页。当前20页，总共81页。1.2.2碱变性法：

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA当前21页，总共81页。流程：1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；2、加入100微升冰冷的液，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA，4～5mg溶菌酶）静置5分钟；3、加入200微升微冷的液（0.2NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡后，冰浴5分钟。5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA当前22页，总共81页。1.2.3影响质粒DNA产量的因素：

1）、寄主菌株的遗传背景使用endA基因发生突变的菌株，编码核酸内切酶从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施：

选择最适的培养条件，以限制在细胞生长期间，体内核酸内切酶的表达；在纯化质粒DNA的过程中，用加热法核酸内切酶使失活；采用最佳的实验流程，减少核酸内切酶的污染并在纯化了质粒DNA之后，迅速除去污染的核酸酶。当前23页，总共81页。

2）、质粒的拷贝数及分子的大小插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷贝数的下降。当前24页，总共81页。1.3质粒载体的构建与类型

天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。

当前25页，总共81页。

第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个EcoR酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tetr），插入外源片断后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。当前26页，总共81页。

ColE1质粒在其唯一的单切割位点EcoRl中克隆外源DNA片断后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。当前27页，总共81页。1.4质粒载体必须具备的基本条件(1)、具有复制起点；

自我增值的基本条件，一般具一个复制子。(2)、具有抗菌素抗性；

理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。(3)、具有若干限制酶切单一位点（CMS）；(4)、具有较小的分子量和较高的拷贝数。

低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因当前28页，总共81页。以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）当前29页，总共81页。

1.4.1.质粒载体的选择记号新陈代谢特性；对大肠杆菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；

四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性大多数质粒本身带有抗菌素基因；抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。当前30页，总共81页。1.5不同类型的质粒载体高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因低拷贝的质粒载体有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。当前31页，总共81页。

(1)失控的质粒载体

复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。Example：pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA占细胞总DNA的50%。当前32页，总共81页。

(2)插入失活型质粒载体

将外源DNA片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。Example：在pBR329质粒载体的EcoR1位点插入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升。

当前33页，总共81页。(3)正选择的质粒载体

正向选择：应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号并可赋予寄主细胞相应的表型。当前34页，总共81页。Example：

质粒pKN80有来自Mu噬菌体DNA的EcoR1-C的片断，编码一种致死功能的kil基因。该质粒在Mu噬菌体的溶源菌株中正常复制；在非溶源菌株中是致死的。在Hind或Hpa位点插入外源DNA片断后，会产生具Ampr表型的Mu噬菌体的非溶源的转化子菌株当前35页，总共81页。正向选择质粒载体的条件限制：1、需要特殊的寄主菌株或选择培养基2、可使用的克隆位点少3、假阳性水平高4、不能够调节插入序列表达活性当前36页，总共81页。

(4)表达型的质粒载体表达载体：

按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。

当前37页，总共81页。主要包括：

大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。

待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。当前38页，总共81页。

当前39页，总共81页。1.6重要的大肠杆菌质粒载体

1、pSC101质粒载体；2、ColE质粒载体；3、pBR322质粒载体；4、pUC质粒载体；5、其它的重要的质粒载体当前40页，总共81页。1.6.1pSC101质粒载体

一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr

）。有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma7种核酸内切限制酶。其中在Hind、BamH、Sma3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活。

是第一个真核生物的克隆载体当前41页，总共81页。当前42页，总共81页。Example1:应用pSC101质粒作基因克隆载体—葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达

金黄色葡萄球菌的质粒p1258,编码若干种能在大肠杆菌检测的结构基因；能被核酸限制酶EcoR切割成4段。当前43页，总共81页。当前44页，总共81页。Example2:应用pSC101质粒作基因克隆载体—在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA

用核酸内切酶EcoR消化非洲爪蟾的核糖体DNA（rDNA），与EcoR消化的pSC101质粒进行重组。在挑取的55个转化子中，经EcoR酶切，电泳后13个转化子含有外源片断。转化率23.6％当前45页，总共81页。当前46页，总共81页。1.6.2ColE1质粒载体

松弛型复制控制的多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。当前47页，总共81页。当前48页，总共81页。

用ColE1质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性：

1、应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便；2、在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。当前49页，总共81页。1.6.3pBR322质粒载体

“P”表示是一种质粒；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。当前50页，总共81页。当前51页，总共81页。pBR322的构建：

为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）

当前52页，总共81页。当前53页，总共81页。pBR322的结构来源当前54页，总共81页。pBR322质粒载体的优点：

1、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，当前55页，总共81页。Example:a.在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。当前56页，总共81页。BXBBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX当前57页，总共81页。b.在Pst或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr基因的失活，产生AmpsTetr表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr表型的细胞可以合成β–内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素β–内酰胺酶Ampr的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps菌落无此反应。当前58页，总共81页。

具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000～3000个拷贝。当前59页，总共81页。

pBR322质粒载体的改良

为了更加实用，人们对pBR322质粒进行了改良，得到许多pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。当前60页，总共81页。应用pBR322质粒作为基因克隆载体

—水稻叶绿体光诱导基因psbA的结构分析

基因psbA编码的蛋白质，与光合作用系统相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，它的第264位氨基酸发生取代反应，由丝氨酸变为甘氨酸，可导致其失去与除草剂阿特拉津结合的能力，推测是三维结构发生了改变；在原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白质在同一位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应，会使他们获得对除草剂的抗性功能。而且，非竞争条件下，对除草剂阿特拉津抗性的千里光属和苋属，干物质产量比敏感植物下降了25%和40%。

当前61页，总共81页。

通过对基因psbA的体外操作，有可能创造出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用pBR322质粒作为载体，成功的克隆了水稻的psbA基因。首先将水稻叶绿体DNA，用EcoR内切酶消化，经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳，回收分子大小为1.8～2.5kb之间的DNA片断。再与经过EcoR内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322质粒DNA连接。然后转化给大肠杆菌，在氨苄青霉素的选择培养基上，形成Ampr转化子菌落群体。用经32p标记的玉米psdADNA探针作菌落杂交，从1000多个菌落中筛选出8个阳性克隆。当前62页，总共81页。对这8个阳性克隆进行进一步的Southern分析，表明6个片断带有长度为2.2kb的编码水稻叶绿体psdA基因。实际上其中1.2kb的片断编码着水稻psdA基因的全部序列。通过dna序列分析表明与高等植物的同原性在92%，与蓝色细菌同源性75%当前63页，总共81页。1.6.4pUC质粒载体

人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

当前64页，总共81页。

一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：

1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；

2、氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。

3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。当前65页，总共81页。AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites, 多科隆位点）LacpromoterlacZ’当前66页，总共81页。pUC质粒载体的形体图当前67页，总共81页。pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;

仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500～700个拷贝。当前68页，总共81页。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第