基因治疗生物化学

基因治疗生物化学第1页/共35页2一、基因治疗的类型

1.基因调控治疗从基因水平调控缺陷基因表达，改善症状镰型细胞贫血症---用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而关闭的γ基因重新开放，产生HbF代替HbA用反义RNA抑制基因表达核酶（ribozyme）切割RNA阻断基因表达肿瘤治疗，在基因水平抑制肿瘤细胞基因恶性表达和引导肿瘤细胞逆转。第2页/共35页3基因治疗的类型（续）2.基因矫正治疗

基因增补—正常基因导入患者体内补偿缺陷基因功能基因替换—以正常基因取代变异基因基因校正—体外对异常基因进行纠正。第3页/共35页4基因治疗的类型（续）按矫正基因的类型分为两种基因治疗：

·生殖细胞基因治疗

—对生殖细胞或早期胚胎细胞进行基因矫正。

·体细胞基因治疗

—以体细胞为受体细胞，不影响下一代常用细胞介导法：选择靶细胞在体外进行基因修饰，再将其输入体内。第4页/共35页5基因置换（genereplacement）

定义：将特定目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。

目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。第5页/共35页6定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。基因同源重组技术又称为基因打靶(genetargeting）细胞内基因同源重组的发生率很低。基因同源重组技术第6页/共35页7基因增补（geneaugmentation）

定义:

通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:有缺陷基因细胞中导入正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。第7页/共35页8基因干预（geneinterference）基因失活

定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。第8页/共35页9（一）反义RNA（antisenseRNA）

1.反义RNA与基因表达调控利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：

（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。第9页/共35页10反义RNA技转移术①受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。

借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义RNA转移。第10页/共35页11反义RNA的优点

受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。

（l）安全性高

（2）反义RNA设计和制备方便

（3）具有剂量调节效应

（4）能直接作用于一些RNA病毒第11页/共35页12核酶(ribozyme)

天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。

在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子而达到治疗疾病的目的。

第12页/共35页13核酶锤头状的二级、三级结构

只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。目录第13页/共35页141.核酶的设计

核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。

（1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。

（2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。第14页/共35页15干扰RNA

1.RNA干扰现象

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。有义RNA（senseRNA）或反义RNA（antisenseRNA）均能抑制线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。

第15页/共35页162.RNA干扰的机制

RNA干扰过程主要有2个步骤：

（1）小干扰性RNA（siRNA）（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。第16页/共35页17研究基因功能的新工具

由于RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。

RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段。

第17页/共35页181.体外化学合成;2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。siRNA的产生第18页/共35页19定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法。（四）自杀基因治疗(SuicideGeneTherapy)第19页/共35页20

（五）基因免疫调节

通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。第20页/共35页21二、基因治疗的条件

·对导入的基因及其产物有详尽了解；

·外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、适量表达；

·不影响受治细胞基因组及表达调控；

导入基因方法安全，载体对靶细胞无害；第21页/共35页22三、基因治疗的原则

对象是病情严重、预后差、别无他法的患者转移的基因被克隆无需高水平表达和精确定量控制就有治疗效果靶细胞获取或回输安全转移基因表达对细胞微环境无严格特异性要求第22页/共35页23四、基因疗法的步骤

目的（治疗）基因的选择根据基因治疗类型选择相应目的基因（增补、替换、添加）基因载体的构建使目的基因在受体细胞内高效、可控、稳定地表达

受体细胞选择易分离获取，体外增殖存活，大量扩增。如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞第23页/共35页24

基因转移(genetransfer)方法

1.病毒介导的基因转移

2.非病毒介导的基因转移第24页/共35页25

1.病毒介导的基因转移系统

病毒载体介导基因转移效率较高据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体。第25页/共35页26反转录病毒的结构及生活周期（1）反转录病毒

第26页/共35页27

（2）腺病毒(adenovirus)载体

通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，尚未发现与肿瘤发生有关联。第27页/共35页28常用基因治疗载体

整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞<7kb腺病毒载体不整合，可能丢失不致病分裂细胞、非分裂细胞

腺相关病毒载体定点整合(19号染色体特定区域)不致病分裂细胞、非分裂细胞<5kb<7.5kb第28页/共35页292.非病毒载体介导的基因转移系统

（1）脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理:

利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。

第29页/共35页30

（2）受体介导转移技术

将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。第30页/共35页31

（3）基因直接注射技术

不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。

将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ。第31页/共35页32

基因直接注射法的优点制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。

第32页/共35页33五、基因治疗的应用治疗恶性肿瘤

治疗黑色素瘤--将已导入IL2基因的TIL细胞回输给病人，启动自身免疫治疗艾滋病--用射线照射已导入HIV基因的成纤维细胞，细胞停止分化，但能产生gp160，将细胞回输给病人，能激活免疫系统，杀伤HIV感染细胞。治疗家族性高胆固醇血症（FH）

肝细胞低密度脂蛋白（LDL）受体基因混乱造成，将LDL基因导入病人离体培养的肝细胞，然后经导管注入门脉循环，进入肝细胞后表达相应功能蛋白。第33