荧光定量PCR技术与常见问题分析

定量PCR是如何工作的当前1页，总共107页。荧光定量PCR是什么一种实时监控目的基因PCR扩增的技术当前2页，总共107页。定量PCR是如何工作的?传统PCR

具有以下基本要素dsDNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer缓冲液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGA当前3页，总共107页。与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行:>双链DNA模板变性>引物与模板退火>引物延伸

新的扩增片段定量PCR是如何工作的?理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍当前4页，总共107页。在PCR混合液中含有荧光物质。定量PCR是如何工作的?当前5页，总共107页。无论哪个型号，所有的荧光定量PCR仪都有三个共同的组成部分定量PCR是如何工作的?当前6页，总共107页。PCRPCRLotsofPCRPCRproduct随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加定量PCR是如何工作的?当前7页，总共107页。Real-timePCR仪会记录每个循环经过每个滤光片的荧光信号变化定量PCR是如何工作的?Cycle1FilterASample1Level:当前8页，总共107页。为什么要用定量PCR？

重复性好

灵敏度高

动力学范围宽一个好的定量PCR数据当前9页，总共107页。1:重复性好当前10页，总共107页。2:灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因当前11页，总共107页。3:动态范围宽兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围(越大越好)当前12页，总共107页。为什么要用定量PCR？

快：节省时间和劳力（不用电泳检测）。当前13页，总共107页。为什么要用定量PCR？

安全：不用EB或放射性物质当前14页，总共107页。定量PCR的化学原理当前15页，总共107页。支持的化学试剂SYBR®GreenITaqMan®当前16页，总共107页。TaqMan®

中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物TaqMan®

化学原理

当前17页，总共107页。第三段短片段序列，又称为探针,位于序列中间TaqMan®

化学原理

当前18页，总共107页。报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye探针标记两种

染料分子TaqMan®

化学原理

当前19页，总共107页。Reporter没有荧光信号（发射）能量光(激发)完整的探针TaqMan®

化学原理

当前20页，总共107页。光能然而，如果探针断裂了……TaqMan®

化学原理

当前21页，总共107页。Denaturation变性(95ºC)TaqMan®

化学原理

当前22页，总共107页。Annealing退火(60ºC)TaqMan®

化学原理

当前23页，总共107页。Taq酶登场……TaqMan®

化学原理

当前24页，总共107页。找到引物序列……TaqMan®

化学原理

当前25页，总共107页。开始延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

当前26页，总共107页。Extension延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

当前27页，总共107页。Extension延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

当前28页，总共107页。?Extension延伸(60ºC)TaqMan®

化学原理

当前29页，总共107页。Taq酶很特别……具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’结合到模板上的DNA片段TaqMan®

化学原理

当前30页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前31页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前32页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前33页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前34页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前35页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前36页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前37页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前38页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前39页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前40页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前41页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前42页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前43页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前44页，总共107页。Taq酶降解探针TaqMan®

化学原理

当前45页，总共107页。TaqMan®

化学原理

当前46页，总共107页。TaqMan®

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当前47页，总共107页。TaqMan®

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当前48页，总共107页。TaqMan®

化学原理

当前49页，总共107页。嗝!TaqMan®

化学原理

当前50页，总共107页。SYBR®GreenI化学原理当前51页，总共107页。SYBR®GreenI染料当前52页，总共107页。SYBR®GreenI染料当前53页，总共107页。SYBR®GreenI染料当前54页，总共107页。SYBR®GreenI染料的缺点非特异结合任意

双链DNA定量结果不准确非特异性PCR产物信号当前55页，总共107页。使用熔解曲线Meltcurve(DissociationCurve)检查反应特异性TemperatureFluorescence当前56页，总共107页。Meltcurve:

导数图谱一个干净的峰=没有无关的产物TemperatureFluorescence当前57页，总共107页。Meltcurve的杂峰可能是引物二聚体当前58页，总共107页。多余的峰是如何产生的?非特异扩增1、转录组中错误的目的基因。2、引物结合在正确的序列,但是既检测基因组DNA又检测cDNA(由于短的内含子,基因组DNA有较高的Tm值)。解决方法：设计引物时至少有一条跨过外显子的结合点

引物二聚体当前59页，总共107页。到底用哪一种化学方法呢？TaqMan®,还是SYBR®Green?...当前60页，总共107页。TaqMan®,还是...

SYBR®GreenI?优点更高的特异性

不会有引物二聚体干扰支持多重荧光实验设计实验方法易于优化缺点价格稍贵优点价格便宜大部分基因以及少量样品均适用缺点特异性稍差必须要做Meltcurves不支持多重荧光设计实验方法通常需要优化当前61页，总共107页。定量PCR的数学原理当前62页，总共107页。怎样获得结果首先让我们定义扩增曲线的各种参数。当前63页，总共107页。PCR的动力学曲线和四个阶段当前64页，总共107页。指数扩增期重复性准确性动态范围3个阶段中最佳时期当前65页，总共107页。只有一个扩增期提供高质量的数据指数扩增期当前66页，总共107页。基线基线（空白）信号的产生是由于背景引起的当前67页，总共107页。阈值默认阈值=基线（背景）信号标准偏差x10当前68页，总共107页。怎么获得结果第一步：确定Ct值当前69页，总共107页。怎么获得结果第二步：比较Ct值当前70页，总共107页。定量PCR的应用绝对定量相对定量阴阳性鉴定基因分型当前71页，总共107页。定量PCR实验设计和流程

---绝对定量和相对定量当前72页，总共107页。定量PCR的实验要素

目的基因样品标准曲线标准品监控系统故障阳性对照监控污染阴性对照校准生物学误差内参(管家基因)校准物理误差参比荧光降低随机误差重复实验当前73页，总共107页。相对定量实验示例实验未处理样本处理后样本目的基因：Plat1实验目的：样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化？当前74页，总共107页。实验流程对照样本当前75页，总共107页。两种相对定量的方法比较Ct（ΔΔCt）法相对标准曲线法样本间目的基因的倍数关系当前76页，总共107页。两种方法的区别

比较Ct(ΔΔCt)法

相对标准曲线法*已知各个基因的扩增效率*每个基因都要做一条标准曲线*不需要每次都做标准曲线*准确的扩增效率计算*简单,经济,通量较高*工作量大,成本高,通量较低当前77页，总共107页。如何选择相对定量的方法当前78页，总共107页。如何选择相对定量的方法当前79页，总共107页。如何选择相对定量的方法在EXCEL中制作图表当前80页，总共107页。如何选择相对定量的方法在EXCEL中制作图表斜率<0.1斜率>0.1比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法当前81页，总共107页。ΔΔCt法必要条件：目的基因和内参基因必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%。当前82页，总共107页。ΔΔCt法如何确认扩增效率接近100%？每条引物一条标准曲线当前83页，总共107页。ΔΔCt法标准曲线可以帮助判定扩增效率例如：斜率-3.3说明扩增效率接近100%；更小的负值（如-3.5）说明扩增效率小于100%公式：E=10(-1/斜率)-1当前84页，总共107页。ΔΔCt法结果计算步骤一：内参基因均一化样本差异Ct目的基因-Ct目的基因=

ΔCt步骤二：处理样本和对照样本作比较

ΔCt处理样本-ΔCt对照样本=

ΔΔCt步骤三：使用公式计算

倍数变化

=2

-ΔΔCt当前85页，总共107页。公式含义2

-ΔΔCt2=循环间扩增产物量的变化（PCR扩增产物倍增）ΔΔCt=处理样本和对照样本之间校正过大循环数的变化所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化。当前86页，总共107页。ΔΔCt法计算示例当前87页，总共107页。ΔΔCt法计算示例为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理。当前88页，总共107页。ΔΔCt法计算示例首先，选择对照样本；接着，均一化对照样本；然后，所有样本和对照样本进行比较。当前89页，总共107页。ΔΔCt法计算示例最后，计算出倍数关系2

–ΔΔCt。当前90页，总共107页。相对标准曲线法每对引物做一条相对标准曲线当前91页，总共107页。相对标准曲线法计算示例表示倍数差异当前92页，总共107页。绝对定量实验

目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系；

要求：

浓度已知

标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%

–仪器质量一致

–试剂质量一致：模板纯度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓

冲液成分

–反应条件一致：循环参数相同、同一次实验标准品的准备当前93页，总共107页。绝对定量实验Don’t:−制备3个点的2倍标准曲线要求：Do:−制备至少5个点的标准曲线(4logs)−去除离散的重复孔，或者有必要时去除整个梯度数据如何制备标准曲线当前94页，总共107页。绝对定量实验

选择目标→提取/PCR→纯化→测定浓度→调整浓度→梯度稀释Ct值在17-30之间，覆盖全部样品浓度区间10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v注：不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v标准品梯度稀释方法当前95页，总共107页。绝对定量实验扩增效率：每个循环中靶分子被作为模板利用的百分比。PCR效率的测定当前96页，总共107页。常见问题分析当前97页，总共107页。1.扩增效率为什么达不到100%主要原因：样品不纯扩增产物太长没有选择合适的引物退火温度引物的设计有错配模板的序列特殊（比如GC含量高）抑制物的存在当前98页，总共107页。2.扩增效率为什么会大于100%主要原因：背景污染非特异性扩增当前99页，总共107页。3.实验结果的重复性不好对每个样品我们都要做重复实验（通常至少为3个重复）目标是所有复孔CT值都相近(通常SD值小于0.167)当前100页，总共107页。3.实验结果的重复性不好重复性好当前101页，