细胞迁移和侵袭实验技术

关于细胞迁移和侵袭实验技术第一页，共三十五页，编辑于2023年，星期三体内实验：皮下移植瘤模型原位移植瘤模型肿瘤细胞运动体外实验第二页，共三十五页，编辑于2023年，星期三肿瘤细胞运动常用研究方法Textinhere侵袭实验趋化运动划痕实验第三页，共三十五页，编辑于2023年，星期三

实验原理

细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。划痕实验（伤口愈合实验，ScratchAssay）第四页，共三十五页，编辑于2023年，星期三操作步骤1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。第五页，共三十五页，编辑于2023年，星期三操作步骤2.在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%；3.用10mltip枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS洗涤2次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。

第六页，共三十五页，编辑于2023年，星期三操作步骤4．放入37℃

5%

CO2培养箱培养。每3h测量一次细胞运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。第七页，共三十五页，编辑于2023年，星期三操作步骤

5.数据处理：每个时间点的距离长度-0时距离=每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0时与实验结束时实验组与对照组的照片。第八页，共三十五页，编辑于2023年，星期三注意事项

1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖就不能忽略。

3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。4.实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。

第九页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第十页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第十一页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第十二页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第十三页，共三十五页，编辑于2023年，星期三实验原理

趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生存、生命的繁衍等具有重要的意义。趋化运动实验（ChemotaxisAssay）第十四页，共三十五页，编辑于2023年，星期三微孔小室中的趋化实验

微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。

滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。第十五页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第十六页，共三十五页，编辑于2023年，星期三BoydenChamber装置第十七页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第十八页，共三十五页，编辑于2023年，星期三实验步骤1.在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3个孔，其中只加BM的孔为阴性对照；2.取对数生长期细胞，0.1%BM重悬细胞，调整细胞浓度为5×105/ml；3.加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3个孔；第十九页，共三十五页，编辑于2023年，星期三实验步骤4.将趋化小室在37℃，5%CO2的孵化箱中孵育3h；5.在膜的两端加上夹子，毛面在PBS液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3次后再蘸取一次，晾干；6.固定,染色第二十页，共三十五页，编辑于2023年，星期三实验步骤7.取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片；8.显微镜观察计数，每孔至少3个随机视野，3个孔的数值取平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别；9.趋化指数(ChemotaxisIndex)=随着趋化诱导因子的浓度梯度而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目第二十一页，共三十五页，编辑于2023年，星期三注意事项1.膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生；2.放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。3.枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5处，迅速加样，不要迟疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液面。4.洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。第二十二页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第二十三页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第二十四页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第二十五页，共三十五页，编辑于2023年，星期三第二十六页，共三十五页，编辑于2023年，星期三肿瘤细胞侵袭试验MatrigelInvassionAssayTranswell系统Transwell小室0.4um孔径聚碳酯膜的扫描电镜第二十七页，共三十五页，编辑于2023年，星期三原理

人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4℃时是液体，在37℃

会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。第二十八页，共三十五页，编辑于2023年，星期三滤膜孔径一般为8mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。原理Transwell

电镜图片第二十九页，共三十五页，编辑于2023年，星期三实验步骤及注意事项1.无菌条件下Matrigel于冰浴融化，用PBS（或DMEMonly培养基）稀释成1mg/ml浓度，-20°C冻存备用；2.取出已稀释好的Matrigel，冰浴融化，以50ml的体积铺于Tramwell小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），37°C放置lh，使Matrigel聚合成凝胶（注意：加基质胶时最好将24孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）；第三十页，共三十五页，编辑于2023年，星期三3.每孔加入200ml1640（或DMEM）培养基使胶重构；4.在Transwell下室中加入趋化因子或10%FBS培养基600ml/孔；5.在上室孔中准确加入细胞l×105

个/孔，细胞悬液体积200ml，置于5%CO2

培养箱于37°C培养24h（注意：细胞量和时间根据实验条件摸索）；6.待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞；实验步骤及注意事项①Transwell小室②上层培养液③细胞④基质胶⑤下层培养液⑥细胞培养板

Transwell侵袭实验示意图第三十一页，共三十五页，编辑于2023年，星期三7.4%中性甲醛固定10分钟，Giemsa染色10分钟，PBS洗涤3次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞(200×)；