不同类型细胞的培养特点

第六章

个别细胞和组织(zǔzhī)的培养第一页，共七十页。

类型：正常(zhèngcháng)细胞培养肿瘤细胞培养第二页，共七十页。第一节正常(zhèngcháng)细胞培养

正常细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难。正常细胞难培养的原因(yuányīn)是它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格.但只要一切条件适当仍有培养成功可能。第三页，共七十页。一、上皮细胞类培养(péiyǎng)

上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；培养中只有(zhǐyǒu)源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。第四页，共七十页。上皮细胞培养有三个难点：①需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则利于(lìyú)细胞生长；②需求特殊培养基；③与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。第五页，共七十页。(一)表皮细胞培养1．特点：在有胶原的底物上易生长；把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养(sìyǎng)层(用射线照射后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。向培养基中加氢化可的松(10μg/m1)、10-6M的异丙基肾上腺素(Isoproterenol)和10ng/m1促表皮生长因子(EGF)能促表皮细胞生长。第六页，共七十页。【饲细胞】饲细胞(FeederCells)也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。饲细胞作用：有同化(tónghuà)营养液的能力。饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成。克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。第七页，共七十页。饲细胞的制备：(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按103

细胞/毫升重新接种培养；(2)在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素，按2ug/105细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30～50戈瑞(Gy)；(3)细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时(xiǎoshí)，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5×104/ml接种入新培养基中；(4)48小时后，即可用于细胞克隆之用。第八页，共七十页。2．表皮细胞培养程序：(1)取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产(zǎochǎn)流产儿皮肤更好，切成0.5~1cm2小块；(2)EDTA处理：先置入0.02％EDTA中室温置5分钟。(3)冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中，置4℃过夜；(4)分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；第九页，共七十页。(5)温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30~60分钟；(6)制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；(7)加培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心(líxīn)，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清.(8)培养：接种入碟皿中，CO2温箱培养。第十页，共七十页。注意事项：：冷消化目的的在于使表表皮和真皮皮结合松散散；如冷消化后后分离(fēnlí)下来的表皮皮膜自身也也已松散，，此时亦可可直接置入入PBS中中用吸管管吹打制备备细胞悬液液；不再经经过第二次次消化。第十一页，，共七十页页。(二)胃胃上皮细胞胞培养(péiyǎng)适于胃上皮皮细胞生长长的条件是是：①胶原酶和和透明质酸酸酶消化法法并用消化化细胞；②应用胶原底底物培养(péiyǎng)；③制备含有特特定成分的的培养基；；第十二页，，共七十页页。培养程序：：(1)取材：取胃溃疡疡或胃癌手手术切除胃胃标本远端端非病变区粘膜少许；；(2)清洗：用含庆大大霉素(400μg/m1)和两性霉霉素(2μμg/m1的Hanks)液漂洗后后，用钝器器剥离下粘粘膜，剪成成1mm大大小；(3)消化：在I型胶原原酶和透明质酸酶酶中，于37℃中消化化80分分钟；(4)离心：收集细胞胞(xìbāāo)悬液，800转/分离心后后，Hanks液液漂洗两次次；第十三页，，共七十页页。(5)接接种：末次离心心后加入含含有1％~2％胎牛牛血清(xuèqīng)的完全培养养基，接种入不不同孔数的的培养板中中；接种量量依不同实实验目的而而定。细胞接种后后一般在16小时时内贴壁，，细胞呈多多角形，成成岛状或片片状生长，，以后逐渐渐联接成片片。初代培培养可维持持2~3周，，第一周末末达高峰，，最后逐渐渐衰退剥落落。第十四页，，共七十页页。(三)肝肝细胞培养养(péiyǎng)肝脏具有取取材方便(fāngbiàn)和易于生长长的优点，，能获得典典型上皮细细胞培养。。1．初代组组织块培养养：肝组织做组组织块培养养效果很好好。取新鲜鲜肝脏，先先剥除被膜膜和血管等等纤维成分分，用刀或或剪刀把肝肝剪成1mm3左右右的的小小块块，，采采用用贴贴壁壁培培养养法法。。肝肝组组织织易易于于贴贴壁壁，，生生长长力力好好，，一一般般次次日日即即可可出出现现生生长长晕晕。。第十十五五页页，，共共七七十十页页。。2．．初初代代消消化化法法培培养养：：(1)把把肝肝组组织织切切成成2~4立立方方毫毫米米的的小小块块，，用用不不合合钙钙镁镁的的BSS液液洗洗两两次次；；(2)移移入入1:1的的0.1％％胰胰蛋蛋白白酶酶和和0.1％％胶胶原原酶酶(都都用用无无钙钙镁镁BSS配配制制)中中，，4℃℃冷冷消消化化10~12小小时时后后，，通通过过250微微米米和和64微微米米尼尼龙龙网网或或不不锈锈钢钢纱纱网网滤滤过过(用用纱纱布布滤滤过过亦亦可可)；；(3)收收集集细细胞胞(xììbāāo)、BSS液液洗洗1~2次次、、计计数数、、接接种种培培养养；；第十十六六页页，，共共七七十十页页。。3．．肝肝脏脏灌灌流流法法：：需用用全全肝肝，，以以较较小小动动物物如如小小鼠鼠和和大大鼠鼠为为好好。(1)无无菌菌解解剖剖动动物物，，取取出出肝肝脏脏，，先先用用BSS洗洗除除血血污污；；(2)取取5ml注注射射器器一一支支(yīīzhīī)，吸吸取取消消化化液液后后，，把把注射射器器头头轻轻轻轻插插入入肝肝管管中中，用用线线绳绳结结扎扎牢牢固固，，以以防防消消化化液液漏漏出出，，轻轻轻轻把把消消化化液液注注入入胆胆管管系系统统，，并并不不时时轻轻柔柔压压肝肝脏脏，，以以便便消消化化液液进进入入肝肝小小叶叶中中；；消化化液液在在肝肝内内停停留留20~30分分后后，，在在吸吸出出消消化化液液的的同同时时并并轻轻柔柔压压肝肝脏脏，，以以使使肝肝细细胞胞脱脱落落和和消消化化液液吸吸出出；；第十十七七页页，，共共七七十十页页。。(3)待待吸吸净净消消化化液液后后，，注注入入(zhùùrùù)离心心管管中中，，低低速速离离心心分分离离，，用用RPMI1640培培养养基基培培养养(较较其其它它培培养养基基为为好好)，，能能获获得得较较纯纯的的肝肝上上皮皮细细胞胞和和获获较较好好的的效效果果。。第十八页页，共七七十页。。(四)内内皮细细胞培养养(péiyǎng)应用材料料：人脐带脐脐静脉、、动物大大动脉等等，用灌流消消化(xiāāohuà)法获取细细胞最为为简便。。第十九页页，共七七十页。。(1)取取产后的的新鲜脐脐带；如如不立即即培养(péiyǎng)可保存于于4℃中中，但不不宜超过过12小小时；；无菌剪取取长10~15厘厘米一一段。其它如胚胚胎和幼幼体动物物的大血血管，亦亦可用于于培养；；(2)先先用三三通注射射器吸温PBS液注注入脐带带的脐静静脉中，，洗除残残血；注入口口处宜用用线绳结结扎，以以防液体体返流；；第二十页页，共七七十页。。(3)用血管钳钳夹紧脐脐带一端端，从另另端向脐脐静脉中中徐徐注注入最终终浓度为为0.1％的胶胶原酶，待末端端出现液液体后结结扎之，，令充满满血管，，注入口口亦应结结扎，以以防液体体返流，，消化3~10分钟钟；(4)吸出含有有内皮细细胞的消消化液，，注入离离心管中中；为获取取更多细细胞，可可再注入入温PBS冲冲洗2~3次彻彻底清除除干净残残余细胞胞，一并并注入离离心管中中离心；；(5)吸除上清清，加1640培养养(péiyǎng)液，制成成细胞悬悬液，接接种入瓶瓶皿中培培养(péiyǎng)，顺利时时2~3天天内细细胞即可可长成单单层。第二十一一页，共共七十页页。第二十二二页，共共七十页页。人脐带易易于获得得，培养养效果好好；细胞胞生长后后，一般般传6~7代后后即衰退退，难以以长期维维持。用用兔血管管内皮细细胞培养养较好，，可传10~30代；；不同(bùtónɡ)部位血管管内皮细细胞生物物学性状状不同(bùtónɡ)，对各种种作用因因素反应应亦有很很大差别别。第二十三三页，共共七十页页。(五)毛毛细血血管(máoxììxuèɡɡuǎn)内皮细胞胞培养毛细血管管(máoxììxuèɡɡuǎn)细小，结结构简单单，内皮皮细胞外外有较多多的结缔缔组织，，进行分分离培养养有很大大困难。。近年毛细细血管培培养已获获成功；；利用人的的小儿包包皮、人人脾脏、、牛肾上上腺、癌癌组织(如卵巢巢癌)等等均可可；第二十四四页，共共七十页页。1．材料料(cáiliàào)：[肿瘤条件件培养基基制备](1)取C3H小鼠鼠的S-180实体体肉瘤组组织；(2)胰蛋白酶酶消化，Dulbecco改改良Eagle氏培培养液15m1(含含10％％小牛血血清)种种到培培养瓶中中培养；；第二十五五页，共共七十页页。(3)在细胞生生长接近近完全汇汇合时，，收集培培养液制制成条件件(tiááojiàn)培养基；；再用含含10％％小牛血血清的新新培养液液后，也也每隔两两天收集集一次，，可获多多量条件件(tiááojiàn)培养基；；(4)4000转转／分离离心后，，再通过过0.22μm微孔孔滤膜滤滤过，-20℃℃冻存备备用(临临用前融融解)。。[凝胶底底层制备备](1)取取60mmFalcon产产培养皿皿，加1%Difco产产明胶(用不合合钙和镁镁的Hanks液配配制)，，铺盖瓶瓶底，形形成薄层层；(2)置置4℃℃过夜；；用前再再用少许许培养液液冲洗一一次。第二十六六页，共共七十页页。2．初代代培养(1)取取材：取新鲜鲜牛肾上上腺数个个，先用用Hanks液液洗除除血污；；(2)消化：剥除被膜膜，分离离出皮质质(pízhì)，切成lmm3小块，加加0.5％胶原原酶室温温中消化化1小小时；每每隔10分钟钟用吸管管吹打悬悬液令消消化充分分；(3)过过滤：通过不锈锈钢纱网网滤过，，网眼要要求只允允许能通通过小于于110微米米长的毛毛细血管管小段；；(4)离心：650rpm，4℃℃，离心心7分分钟后，，弃掉上上清胶原原酶；第二十七七页，共共七十页页。(5)再离心：：沉淀物用用培养液液重悬并并离心，，再重悬悬，再离离心，共共两次；；(6)制细胞悬悬液：末次沉淀淀物仍用用含10％小牛牛血清的的Dulbecco改改良Eag1e氏氏培养液液重悬后后，稍吹吹打；(7)接种：接种入铺铺有明胶胶底层的的培养皿皿中，37℃培培养；在在培养头头1~3小小时中中，毛细细血管小小段和内内皮细胞胞最先贴贴附于底底物上，，而肾上上腺细胞胞和成纤纤维细胞胞却仍在在培养液液中漂浮浮；(8)换液：：吸除培培养液液，再再加入(jiārù)肿瘤条条件培培养液液；每两两天换换液一一次。。毛细细血管管小段段一般般成自自1~4个个内内皮细细胞，，以后每每个小小段在在底物物上慢慢慢展展成特特殊形形态的的细胞胞岛，，能持持续2~5天天。第二十十八页页，共共七十十页。。3．毛毛细血血管内内皮细细胞分分离培培养：：(1)初初代培培养2~3天天后，，镜下下确认认几个个毛细细血管管内皮皮细胞胞岛，，在培培养皿皿背面面，用用不脱脱色笔笔划圈圈圈起起；(2)镜镜下检检查，，如圈圈内残残有非非内皮皮细胞胞时，，可用用显微微(xiǎnwēi)细针在在倒置置显微微(xiǎnwēi)镜下挑挑除；；用细细胞解解剖器器也可可，宜宜在净净化台台无菌菌气流流中、、打开开培养养皿盖盖进行行，但但时间间不宜宜过长长(15~20分分钟)；圈圈外非非内皮皮细胞胞可用用无菌菌胶刮刮刮除除；第二十十九页页，共共七十十页。。(3)用用培养养液漂漂洗两两次，，以去去除漂漂浮细细胞；；(4)剩剩余内内皮细细胞岛岛如小小(5~20个个细细胞)而而少时时，生生长增增殖常常变得得缓慢慢或完完全不不生长长，此此时需需加入入(jiārù)3T3等饲饲细胞胞；饲饲细胞胞接种种量为为4000细细胞／／cm2；(5)当当内皮皮细胞胞充满满所有有饲细细胞空空间后后，用用胰蛋蛋白酶酶消化化、离离心、、加入入肿瘤瘤条件件培养养基；；(6)接接种入入明胶胶底物物皿中中继续续培养养(饲饲细胞胞死亡亡被淘淘汰)，细细胞增增殖生生长汇汇合后后，按按1:5传传代代。第三十十页，，共七七十页页。第三十十一页页，共共七十十页。。二、结结缔组组织(jiédì-zǔǔzhī)类细胞胞培养养(一)成成纤维维细胞胞培养养包括人人在内内的各各种成成纤维维细胞胞都很很容易易(róóngyìì)培养，，也是是其它它组织织培养养时的的副产产物，，极易易获得得。用人或或动物物胚体体为好好；动动物可可用小小鼠或或鸡胚胚，去去头和和内脏脏，剪剪成小小碎块块后，，用胰胰蛋白白酶消消化法法培养养；如如为人人胚，，可取取皮肤肤培养养。幼幼儿包包皮是是培养养成纤纤维细细胞的的很好好对象象。第三十十二页页，共共七十十页。。小鼠成成纤维维细胞胞培养养(pééiyǎng)条件12.5~14.5d胎胎龄的的小鼠鼠胎儿儿分离离效果果最好好；最佳培培养基基为DMEM添添加15%小牛牛血清清；第3代代细胞胞增殖殖最旺旺盛；；室温条条件(tiáojiàn)下，0.125%胰胰蛋白白酶消消化时时间以以8~10min为为宜。。在培养养ES细胞胞时，，应选选择第第3~5代代的小小鼠成成纤维维细胞胞作为为饲养养层细细胞。。第三十十三页页，共共七十十页。。小鼠成成纤维维细胞胞(xììbāāo)；细细胞(xììbāāo)来源：：swiss小小鼠胚胚胎第三十十四页页，共共七十十页。。第三十十五页页，共共七十十页。。(二)巨巨噬细细胞培培养巨噬细细胞属属免疫疫细胞胞，有有多种种功能能，是是研究究细胞胞吞噬噬、细细胞免免疫和和分子子免疫疫学的的重要要对象象。巨噬细细胞容容易获获得，，便于于(biànyúú)培养，，并可可进行行纯化化。但但属不不繁殖殖型细细胞群群，难难以长长期生生存，，好的的条件件下仅仅能生生活2~3周，，因之之多用用作初初代培培养。巨噬细细胞也也能建建成无无限细细胞系系；大大多来来自小小鼠，，如P388D-1、J774A．1、RAW309、、Cr.1等等。。第三十六页页，共七十十页。1．培养技技术(jìshù)要点：[来源和取取材]巨巨噬细胞可可来源于人人胸水、腹腹水、血和和透析液等等材料。实验多从动动物血液、、肺、脾和和胸腹腔获获取，其中中以从动物物腹腔取材材最常用。。用40μμg的PHA注注入腹腔中中，能产生生6~8×106个细胞，而而且无刺激激性，效果果较好。第三十七页页，共七十十页。2．培养方方法：培养巨噬细细胞可用各各种方法和和各种来源源获取细胞胞，其中以以小鼠腹腔腔取材法最最为实用。。人的材料料除来源不不同外，培培养方法大大同小异。。[程序](1)实实验前三天天，向每只只小鼠腹腔腔内注入无无菌硫基乙乙酸肉汤1ml(勿注入肠肠内)；(2)引引颈杀死动动物；手提提鼠尾将全全鼠浸入70％酒精精中3~5秒秒；(3)置置动物于解解剖台上，，用针头固固定(gùdììng)四肢，双手手持镊撕开开皮肤拉向向两侧，暴暴露出腹膜膜，但勿伤伤及腹膜壁壁；(4)再再用70％％酒精擦洗洗腹膜壁后后，用注射射器吸10mlEag1e液注入入腹腔中，，同时从两两侧用手指指揉压腹膜膜壁，令液液体在腹腔腔内充分流流动；第三十八页页，共七十十页。(5)用用针头轻轻轻挑起腹壁壁，使动物物体微倾向向一侧，使使腹腔中液液体集于针针头下吸取取入针管内内；(6)小小心拔出针针头，把液液体注入离离心管中，，(4℃℃)离心10分钟钟后，去上上清，加10mlEagle培培养基；(7)计计数细胞，，每只小鼠鼠可产生20~30×106细胞，其中中90％为为巨噬细胞胞；(8)为为获取3××105个贴附细胞胞／平方厘厘米，需接接种2.5×106／m1；(9)为为纯化化培养(péiyǎng)细胞，去去除其它它白细胞胞，接种种数小时时后，去去除培养养(péiyǎng)液，用Eagle液液冲洗1~2次次后，再再加新Eagle培培养(péiyǎng)液置37℃CO2温箱中培培养。第三十九九页，共共七十页页。第四十页页，共七七十页。。三、肌组组织(zǔzhī)细胞培养养以心肌和和骨骼肌肌培养较较为实用用。(一)骨骨骼肌肌细胞培培养动物胚或或幼体的的大腿肌组组织为最最好的培培养材料料。取材常常用生后后1~2天天的乳乳鼠(Wistar大大鼠更更好)。。(1)取材：杀死动物物，无菌菌取大腿腿肌组织织，切成成0.3~0.5厘米米小块；；(2)消化：用不含钙钙镁离子子的Hanks液配配的0.25％％胰蛋白白酶(yídànbááiméi)消化，无无菌纱网网或纱布布滤过，，合成培培养基加加10％％小牛(或马)血清培培养，为促进分分化可加加1％的的胎汁汁；第四十一一页，共共七十页页。(3)接种：细胞接种种量为2×106/皿；接接种在胶胶原或明明胶的底底物上能能促进细细胞分化化。明胶制备备比较简简单，常常用Hanks液配配的0.01％％明胶。。生长特点点：细胞生长长开始呈呈纺锤形形，培养养50~52小小时后将将出现融融合形成成肌细胞胞状多核核纤维。。数日后后融合停停止，此此时能观观察(guāānchá)到横纹。。一般在在融合后后二三天天内能见见到收缩缩现象；；因收缩缩运动有有时可导导致细胞胞从底物物脱离。。第四十二二页，共共七十页页。(二)心肌细胞胞培养(péiyǎng)最常用材材料：鸡胚心肌肌、小鼠鼠、大鼠鼠以及人人胎儿心心肌等都都可应用用。心肌是比比较容易易培养和和生长(shēēngzhǎng)的组织，，可应用用多种方方法进行行培养，，如悬滴培养养、组织织块培养养和消化化培养法法等，主要要取心室肌培养，均均能获得得良好的的生长效效果。第四十三三页，共共七十页页。[程序](1)选选新鲜鲜受精鸡鸡卵，置置温箱中中孵育(fūyù)(温箱中中放有水水槽，以以维持箱箱内湿度度)；每每日翻动动一次(180度)，孵育育(fūyù)9~12天天；(2)取取鸡胎胎；(3)用用眼科科剪剪开开胸腔，，剥出心心脏，置置入皿中中用Hanks液漂漂洗1~2次；；(4)小小心剪剪除大的的动静脉脉，保留留心室肌肌；用组织块或或消化培培养法均均可。初代培培养的鸡鸡胚心肌肌呈纺锤锤形，纯化及生生长特点点：常杂有成成纤维细细胞和内内皮细胞胞；心肌细胞胞亦较其其它成分分贴壁慢慢，可反反复贴壁壁法排除除其它细细胞成分分。在培培养成功功时，相相差显微微镜下可可观察到到横纹；；一周后后便可出出现节律律性收缩缩现象。。第四十四四页，共共七十页页。乳鼠心肌肌细胞原原代培养养(péiyǎng)第四十五五页，共共七十页页。第四十六六页，共共七十页页。四、神经经组织细细胞培养养神经组织织主要由由两种神神经细胞胞(xìbāo)(神经元元和神经经胶质细细胞(xìbāo)）组成。。神经元为为高度分分化的细细胞，在在组织发发生晚期期已失掉掉增殖能能力，对对生存条条件要求求高，只有在适适宜情况况下，如如接种在在胶原底底层上，，或在加加入神经经生长因因子(NGF)和胶胶质细胞胞因子时时，才能能生存，，并可能能出现一一定程度度的分化化现象，，如长出出突起等等，但却却难使之之增殖；；即使培养养胚胎组组织情况况也是如如此。第四十七七页，共共七十页页。神经胶质质细胞为为较易培培养成分分，它分分少突、、星形和和小胶质质三种。神经胶质质细胞与与神经元元有共存存(gòngcúún)关系。第四十八八页，共共七十页页。人脑胶质质瘤细胞胞(xìbāo)第四十九九页，共共七十页页。大鼠c6胶质细细胞(xìbāo)第五十页页，共七七十页。。第五十一一页，共共七十页页。(一)初初代培培养神经元能能发生一一定分化化现象，，如生长长突起，，但因无无增殖能能力，最最后衰退退死亡；；但神经经胶质尤尤以星形形细胞能能继续(jìxù)生存和分分裂增殖殖。(二)传传代培培养神经胶质质细胞是是神经组组织中比比较容易易培养的的成分。。不仅能能获得生生长的胶胶质细胞胞并可形形成能传传代的二二倍体细细胞系。。第五十二二页，共共七十页页。(三)培培养方方法人脑组织织可用于于神经胶胶质细胞胞培养，，培养组组织来自自手术室室无菌取取脑髓灰灰质或白白质均可可用于培培养，1．程序序：(1)细胞悬液液制备(zhììbèi)：获取脑组组织后，，先仔细细剥除脑脑膜和血血管等纤纤维成分分，置入入Hanks液液中漂漂洗1~2次后后，置于于30~50倍的的Hanks液液中；；脑组织织比较柔柔软，反反复吹打打即可制制备成细细胞悬液液；(2)排除脂肪成分分和其它碎块块：把悬液注入入离心管中，，在室温直立立5~10分钟后后，细胞或细细胞团块自然然下沉，脂肪肪等杂物易漂漂浮于悬液表表层，吸除上上清，如此反反复二三次可可获较多的细细胞成分；第五十三页，，共七十页。。(3)滤过、计数、、接种：向末次沉降物物中加入适量量营养液，通通过纱网或纱纱布滤过，计计数细胞并调调整好细胞密密度，接种入入培养瓶或皿皿中，置5％％C02温温箱中培养；；(4)传代：细胞生长汇合合后，可用0.25％胰胰蛋白酶消化化(xiāohuà)法做传代处理理。第五十四页，，共七十页。。2．生长特点点：接种后初期，，细胞可能(kěnéng)出现飘浮不贴贴壁现象，贴贴壁后在短期期内也可能(kěnéng)不见细胞分裂裂现象；细胞胞适应环境过过程较长，然然而一旦生长长后，即能进进入较旺盛的的增殖状态。。生长开始常杂杂有巨噬细胞胞、成纤维细细胞和上皮细细胞等，传二二、三代后，，这些成分即即消失，逐渐渐形成均一的的星形胶质细细胞，一般形形成连接不甚甚紧密的单层层细胞第五十五页，，共七十页。。第二节肿肿瘤(zhǒngliú)细胞培养肿瘤细胞在组组织培养中占占有核心的位位置，首先癌癌细胞是比较较容易培养的的细胞，当前前(dāngqián)建立的细胞系系中癌细胞系系是最多的。。肿瘤细胞培养养是研究癌变变机理、抗癌癌药检测、癌癌分子生物学学极其重要的的手段。第五十六页，，共七十页。。培养方法肿瘤细胞培养养成功关键在在于：取材、、成纤维细胞胞的排除、选选用适宜(shìyíí)的培养液和培培养底物等几几个方面。初代培养应用用组织块和消消化培养法均均可。一、要点1．取材：人肿瘤细胞来来自外科手术术或活检瘤组组织。取材时时尽量避免用用退变组织，，要挑选活力较好好的部位。癌癌性转移淋巴巴结或胸腹水水是好的培养养材料。第五十七页，，共七十页。。2．培养基：：肿瘤细胞对培培养基的要求求不如正常(zhèngcháng)细胞严格，一一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培培养基等皆可可用于肿瘤细细胞培养。肿肿瘤细胞对血血清的需求比比正常(zhèngcháng)细胞低，正常常(zhèngcháng)细胞培养不加加血清不能生生长，肿瘤细细胞在低血清清培养基中也也能生长。肿肿瘤细胞对培培养环境适应应性较大。培养养肿肿瘤瘤细细胞胞仍仍需需加加血血清清和和相相关关生生长长因因子子培培养养更更易易成成功功。。第五五十十八八页页，，共共七七十十页页。。3．．成成纤纤维维细细胞胞的的排排除除：：成纤纤维维细细胞胞常常与与肿肿瘤瘤细细胞胞同同时时混混杂杂生生长长，，致致难难以以纯纯化化肿肿瘤瘤细细胞胞。。而而且且(éérqiěě)成纤纤维维细细胞胞常常比比肿肿瘤瘤细细胞胞生生长长得得快快，，最最终终能能压压制制肿肿瘤瘤细细胞胞的的生生长长。。因因此此排排除除成成纤纤维维细细胞胞成成为为肿肿瘤瘤细细胞胞培培养养中中的的关关键键。。第五五十十九九页页，，共共七七十十页页。。成纤纤维维细细胞胞排排除除法法1．．机机械械刮刮除除法法：：是用用不不锈锈钢钢丝丝末末端端插插有有橡橡胶胶刮刮头头(用用胶胶塞塞剪剪成成三三角角形形插插以以不不锈锈钢钢丝丝)，，或或裹裹少少许许脱脱脂脂棉棉制制成成，，装装入入试试管管中中高高压压灭灭菌菌后后备备用用(也也可可用用特特制制电电热热烧烧灼灼器器刮刮除除)。。刮刮除除程程序序为为：：(1)标标记记：：镜镜下下观观察察，，用用不不脱脱色色笔笔在在培培养养瓶瓶皿皿的的背背面面圈圈下下生生长长肿肿瘤瘤细细胞胞的的部部位位(bùùwèèi)；(2)刮刮除除：：弃弃掉掉培培养养液液，，把把无无菌菌胶胶刮刮伸伸入入瓶瓶皿皿中中，，肉肉眼眼或或显显微微镜镜窥窥视视下下，，刮刮除除无无标标记记空空间间；；(3)用用Hanks液液冲冲洗洗一一两两次次，，洗洗除除被被刮刮掉掉的的细细胞胞；；(5)注注入入培培养养液液继继续续培培养养，，如如发发现现仍仍有有成成纤纤维维细细胞胞残残留留，，可可重重复复刮刮除除至至完完全全除除掉掉为为止止。。第六六十十页页，，共共七七十十页页。。2．．反反复复贴贴壁壁法法：：根据据肿肿瘤瘤细细胞胞(xììbāāo)比成成纤纤维维细细胞胞(xììbāāo)贴壁壁速速度度慢慢的的特特点点，，并并结结合合使使用用不不加加血血清清的的营营养养液液，，(1)细细胞胞生生长长达达一一定定数数量量后后，，倒倒出出旧旧培培养养液液，，用用胰胰酶酶消消化化后后，，Hanks冲冲洗洗2次次，，加加入入不不含含血血清清的的培培养养液液，，吹吹打打制制成成细细胞胞悬悬液液；；(2)编编号号为为A、、B、、C三三个个培培养养瓶瓶；；首首先先把把悬悬液液接接种种入入A培培养养瓶瓶中中，，置置温温箱箱中中静静止止培培养养5——20分分钟钟后后，，轻轻轻轻倾倾斜斜培培养养瓶瓶，，让让液液体体集集中中瓶瓶角角后后慢慢慢慢吸吸出出全全部部培培养养液液，，再再接接种种入入B培培养养瓶瓶中中后后；；向向A瓶瓶中中补补充充少少许许完完全全培培养养液液置置温温箱箱中中继继续续培培养养；；(3)B瓶瓶中中细细胞胞5~20分分钟钟后后，，按按处处理理A的的方方法法，，把把培培养养液液注注入入C培培养养瓶瓶中中；；再再向向B瓶瓶中中补补加加完完全全培培养养基基。。第六六十十一一页页，，共共七七十十页页。。当三三个个瓶瓶内内都都含含有有培培养养(pééiyǎǎng)液后后，，均均在在温温箱箱中中继继续续培培养养(pééiyǎǎng)。如如操操作作成成功功，，次次日日观观察察可可见见A瓶瓶主主要要为为成成纤纤维维细细胞胞，，B瓶瓶两两类类细细胞胞相相杂杂，，C瓶瓶可可能能主主要要为为癌癌细细胞胞。。必必要要时时可可反反复复处处理理多多次次，，直直至至癌癌细细胞胞纯纯化化为为止止。。第六六十十二二页页，，共共七七十十页页。。3．．消消化化排排除除法法：：(1)先先是是用用0.5％％胰胰蛋蛋白白酶酶和和0.02％％EDTA(1:1)混混合合液液漂漂洗洗培培养养细细胞胞一一次次，，然然后后再再换换成成新新的的混混合合液液继继续续消消化化，，并并在在倒倒置置显显微微镜镜下下窥窥视视和和不不时时摇摇动动培培养养瓶瓶，，到到半半数数细细胞胞脱脱落落下下来来后后，，便便立立即即停停止止消消化化；；(2)把把消消化化液液吸吸入入离离心心管管中中，，离离心心去去上上清清，，吸吸入入另另瓶瓶中中，，加加培培养养液液置置温温箱箱中中培培养养；；向向原原瓶瓶内内也也补补加加新新的的培培养养液液继继续续培培养养。。用用此此法法处处理理后后，，成纤维维细胞胞比肿肿瘤细细胞易易先脱脱落，经过过(jīīngguò)几次反反复处处理，，可能能把成成纤