植物总的提取与电泳

关于植物总的提取与电泳第一页，共二十四页，编辑于2023年，星期一1.实验目的和要求掌握RNA制备以及常用鉴定方法的原理、操作步骤、注意事项和技术关键。第二页，共二十四页，编辑于2023年，星期一2.相关基础知识由于RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，如mRNA,它携带了DNA的全部编码信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northernblot、RT-PCR、构建cDNA文库、GeneChips以及体外翻译等实验。第三页，共二十四页，编辑于2023年，星期一由于RNase极稳定，所以，在操作RNA时，要格外仔细，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必须对所用器皿进行RNase灭活处理。如用180oC干烤8小时以上处理玻璃器皿，或用0.1的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相关的缓冲液也需要用0.1DEPC水处理，但Tris-Cl缓冲液等不可以用DEPC处理。注意：DEPC有致癌之嫌，必须小心操作，防止接触与吸入！第四页，共二十四页，编辑于2023年，星期一植物细胞内的RNA主要是rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和mRNA（占1～5％）。rRNA含量最丰富，由25S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端都有一个polyA尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)层析柱从总RNA中将mRNA分离出来。一般情况下，提取的总RNA也可用于Northernblot试验。第五页，共二十四页，编辑于2023年，星期一第六页，共二十四页，编辑于2023年，星期一提取植物RNA时，要注意的问题：1）一般用机械研磨的方法破碎植物组织细胞；2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白与RNA分离并释放出RNA；3）抑制内源和外源RNase活性；4）将RNA与DNA、蛋白质及其它细胞成分分开。第七页，共二十四页，编辑于2023年，星期一苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，常用的有3种:第八页，共二十四页，编辑于2023年，星期一本实验采用QIAGEN试剂盒，其原理是依据胍盐法。即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有RNase抑制剂，抑制RNase活性，保证RNA的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶液均质化，包括RNA在内的分子物质通过离心柱。加入乙醇后，再过第二个离心柱，RNA就结合在柱子底部有硅胶的膜上，洗去其它杂质，最后用无RNase的水溶出RNA。该柱子可结合100g大于200bp的RNA，所以应控制起始材料的用量。第九页，共二十四页，编辑于2023年，星期一RNA的检测：RNA的检测主要用琼脂糖凝胶电泳，分为非变性电泳和变性电泳。一般变性电泳用的最多是甲醛变性电泳（如Northernblot实验过程中）。第十页，共二十四页，编辑于2023年，星期一由于RNA分子是单链核酸分子，它不同于DNA的双链分子结构，其自身可以回折形成发卡式二级结构及更复杂的分子状态，以至通过一般传统的琼脂塘凝胶电泳难以得到依赖于分子量的电泳分离条带，为此电泳上样前将样品于65摄氏度加热变性5分钟，使RNA分子的二级结构充分打开，并且在琼脂糖凝胶中加入适量的甲醛，可保证RNA分子在电泳过程中持续保持单链状态，因此，总RAN样品便在统一构像下得到了琼脂糖凝胶上的依赖于分子量的逐级分离条带。第十一页，共二十四页，编辑于2023年，星期一而且RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜的结合。RNA通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，可以直观快捷的分析RNA质量之优劣，当有标准的“分子标尺”（marker）存在时，还可相对客观的对总RNA样品进行定性和定量。为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。第十二页，共二十四页，编辑于2023年，星期一3.实验材料与试剂材料：新鲜植物组织（水稻）试剂：QiagenRNeasy植物试剂盒，甲醛，琼脂糖电泳系统，凝胶成象系统等。第十三页，共二十四页，编辑于2023年，星期一4.实验方法和步骤第十四页，共二十四页，编辑于2023年，星期一第十五页，共二十四页，编辑于2023年，星期一实验步骤（每一步均要求无RNase污染）①称取新鲜材料100mg，液氮速冻；②在预冷的研钵中并在液氮中将材料研磨成细粉末，转移到2ml或1.5ml

离心管中；③待液氮挥发（但不能解冻）后，加入

450μl提取缓冲液RLT，混匀后在

56℃下温育1～3min；第十六页，共二十四页，编辑于2023年，星期一④将裂解液加到离心柱（淡紫色）上下接一个2ml收集管，最大转速离心

2min。裂解液通过柱子时被均质化小心吸取上清液，转移到另一新离心管；加入0.5倍体积（225μl）96～100%

乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能会出现沉淀，无影响；第十七页，共二十四页，编辑于2023年，星期一将混合液全部（包括沉淀675μl）转移到吸附离心柱（粉红色）内，下接2ml的收集管，10000rpm离心15秒。弃去管内液体；⑦加入700μlRW1缓冲液，10000rpm转速下离心25秒，弃去收集管；⑧将离心柱转移到一个新的2ml收集管上，加入500μlRPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃去管内液体重复使用收集管；第十八页，共二十四页，编辑于2023年，星期一加入500μlRPE到离心柱内，最大转速离心2min，干燥离心柱，弃去收集管；⑩把离心柱接在一个新的1.5mlEppen管上，加入30～50μl无RNase水（0.1%DEPC处理），10000rpm离心1min，洗出RNA。若RNA产量在20μg以上，用30～50μl无RNase水再洗脱1次。RNA样品保存于-20℃备用。第十九页，共二十四页，编辑于2023年，星期一琼脂糖凝胶非变性电泳

所需试剂：

10ⅹ凝胶缓冲液吗啉代丙磺酸（MOPS）（pH7.0）200mmol/LNaAC50mmol/LEDTA（pH8.0）10mmol/L

用DEPC水配制，用NaOH调节pH＝7.0。过滤除菌后避光保存。

10ⅹ电泳上样缓冲液

50％（V/V）甘油（用DEPC处理的水稀释）

10mmol/LEDTA（pH8.0）

0.25％（m/V）溴酚蓝

0.25％（m/V）二甲苯青FF第二十页，共二十四页，编辑于2023年，星期一凝胶制备（1.2％）：用1ⅹ凝胶缓冲液配制1.2％的凝胶，至少使其凝固30分钟后进行上样；样品制备：在离心管中，将RNA样品与10ⅹ上样缓冲液以9:1比例混匀，迅速在冰上冷浴5分钟，瞬时离心数秒。RNA上样量为2-30g，本次实验为10g；上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入加样孔，以5V/cm的电压电泳1h～1.5h；待溴酚蓝迁移至凝胶长度的4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液中染色约30min；在紫外灯下观察结果(如果用于Northernblot,在凝胶转膜前应做好移动距离的标记)。步骤：第二十一页，共二十四页，编辑于2023年，星期一琼脂糖凝胶甲醛变性电泳步骤：制备凝胶(1.2％)：称1.2克琼脂糖，加72mlDEPC处理的水，加热溶化。冷却至60oC，在通风厨内加入10×凝胶缓冲液10ml，甲醛（37％）18ml，混均后到入凝胶模具中。样品制备：在离心管里，将RNA样品与10×样品缓冲液以9：1比例混合。65oC温浴5－10分钟，迅速在冰上冷浴5分钟，瞬时离心数秒。对于Northern杂交实验，总RNA上样量可达到10-30g。第二十二页，共二十四页，编辑于2023年