植物基因功能研究策略

植物基因功能研究策略第一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一目录基因功能研究的内容基因功能研究的意义基因功能研究的现状基因功能研究策略正向遗传学策略反向遗传学策略第二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一Whatisgene?InGenetics–

thebasicunitofhereditythatistransmittedfromparentstooffspringinreproduction,whichdeterminesinheritedtraits.InMolecularBiology-entirenucleicacidsequencenecessaryforthesynthesisofafunctionalpolypeptide(proteinchain)orfunctionalRNA现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列总称，是遗传物质的最小功能单位。

第三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一WhatisGeneexpression?第四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一基因功能研究的内容基因功能研究内容功能基因鉴定基因表达规律基因产物生化功能基因表达的生理功能第五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一植物基因功能研究的目标

确定和理解决定植物生命活动的所有基因，从分子、生化和生理水平上揭示植物生命活动机理。这些知识最终将会提高人类驾驭植物生产的能力。第六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一植物基因功能研究的重要意义提高利用常规方法培育新品种的能力；提高利用基因工程手段改良植物品种的能力；采取更有针对性的栽培生产措施，提高生产效率；更有效的利用植物资源生产人类所需要的产品；提高对珍稀植物的保护能力。第七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一植物基因功能研究的现状在拟南芥、水稻基因组和其它作物已完成测定的序列中，只有部分基因进行了功能研究。多数只通过ESTs和OFR等进行了鉴定。许多基因在植物生长发育中的确切功能和作用还不清楚。基因测序的步伐远大于基因功能研究的脚步，公共数据库的DNA序列每天都以数万核苷酸的速度增加。第八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一DNA序列的主要数据库/

NationalCenterforBiotechnologyInformation

/

MaizeGDBisfundedbyacooperativeagreementthroughthe

USDAAgriculturalResearchService.植物基因功能研究的现状第九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一植物基因功能研究的现状第十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一DNA序列的主要数据库/

SGDTM（SaccharomycesGenomeDatabase）isascientificdatabaseofthemolecularSaccharomycesbiologyandgeneticsoftheyeastSaccharomycescerevisiae,whichiscommonlyknownasbaker'sorbuddingyeast.植物基因功能研究的现状第十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一植物基因功能研究策略正向遗传学策略

forwardgeneticsstrategy反向遗传学策略

reversegeneticsstrategy第十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略

forwardgeneticsstrategy表现型基因型PhenotypeGenotype第十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略

诱变

突变体筛选克隆基因基因功能技术路线第十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略基因突变基因失活或产物无功能recessive基因表达减弱或产物活性降低基因表达加强或产物具有新功能dominant基因突变类型第十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略诱变剂Mutagenesis化学诱变剂

Chemicalmutagens辐射

RadiationTDNA和转座子插入

TDNAortransposoninsertion

诱变第十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一基因突变的分子基础按突变发生的原因分类

自发突变(spontaneousmutation):在自然状况下发生的突变。

诱发突变(inducedmutation):有机体暴露在诱变剂中引起的突变。一.自发突变的分子基础自发突变可能由DNA复制错误,自发损伤和转座因子等多种原因引起。(一)DNA复制中的错误遗传物质是DNA,DNA复制是半保留复制,如果发生错误,引起碱基替换(basesubstitution),即一对碱基被另一对碱基替换，造成DNA遗传信息的改变。从而导致基因突变。第二十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一

正常情况下,A-T配对,氨基态的腺嘌呤(A)只与胸腺嘧啶(T)配对,但有时可转变成稀有的亚氨基形式,可以与胞嘧啶配对,形成A-C,再经一次复制,DNA分子中的A-T对变成了G-C对.这种互变异构可以在DNA复制中自发产生。第二十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一碱基替换可以分为转换和颠换:1.转换(transitions):嘌呤替代嘌呤,或嘧啶替代嘧啶。

AG或GA,TC或CT

2.颠换(Tranversions):嘌呤替代嘧啶,或嘧啶替代嘌呤。

AC,AT,CA,TA

3.移码突变（frame-shiftmutation）:在DNA复制中发生增加或减少一个或几个碱基对所造成的突变。移码突变可造成蛋白质分子发生较大的结构改变。

第二十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一(二)自发损伤(spontaneouslesions)

即自然产生的DNA损伤引起突变,如脱嘌呤和脱氨基等。

1.脱嘌呤：最为常见，由于DNA分子中碱基和脱氧核糖间的糖苷键受到破坏，从而引起一个鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(a)从DNA分子上脱落下来。造成DNA损伤，产生无嘌呤位点，在DNA复制中引入错误；或由修复系统移去无嘌呤位点或插入一个碱基而引起突变。

2.脱氨基：胞嘧啶脱氨基变成U,U与A配对，结果使G-C对变成A-T对（转换)。

3.氧化性损伤：个体自然产生的氧化基，氧化物如超氧自由基,氢氧自由基及过氧化基等，能对DNA造成氧化性损伤，引起突变，导致人类疾病。第二十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一烯醇式结构第二十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一玉米中控制分枝的tb1基因是一个转录因子，该基因上游>41kb作为顺式调控因子，调控tb1基因的表达，玉米中tb1的表达量是大刍草中的2倍，该基因表达上的变化造成玉米和大刍草形态上的巨大差异。Nature,1997,386:485-488第二十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一玉米中tga1基因控制颖壳的有无，该性状只有一个基因控制，由于tga1基因一个氨基酸的替换，造成玉米和大刍草如此巨大的表型差异。Nature,2005,436:714-719第二十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一水稻落粒基因在2006年的science上有两篇文章，一篇是比较indica和野生稻sh4，是由于一个氨基酸的替换造成的，另一篇是日本人做的，比较indica和japonica的qSH1，此基因是由于调控区一个SNP引起的。

Science,2006,311:1936-1939第二十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一小麦的Q基因具有多效性，影响到脱粒、小穗长度，株高和抽穗等一系列性状。该基因也是一个转录因子。也是由于一个氨基酸的替换影响了同源二聚体的形成。Genetics,2006,172:547-555第二十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一小麦中的Gpc-B1基因，NAC类转录因子，在野生小麦中由于该基因的表达，籽粒蛋白含量、锌和铁含量较栽培小麦提高很大，而栽培小麦中，该基因由于一个碱基的插入造成移码突变而失活，但却使持绿性增强。Science,2006,314:1298-1301第二十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一拟南芥中控制种子大小的AP2基因突变体中在第一个AP2结构域有一个11bp的缺失，造成nullmutation，结果种子增大，细胞数增大，细胞体积增大。PNAS,2005,102:3123-3128第三十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一控制番茄果型大小的fw2.2是最早克隆的QTL，仅仅因为成熟晚期表达丰度的不同，造成野生型和栽培型果型大小的如此大的差别。Science,2000,289:85-88第三十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一

二诱发突变的分子基础

各种诱变剂（物理或化学的）可诱发基因的突变。诱变剂可以取代碱基，改变碱基或破坏碱基，使DNA发生错配，而引起基因突变。(一)碱基类似物：与碱基结构类似，可替代正常碱基掺入DNA分子，引起碱基替换。如5-溴尿嘧啶（BU）是胸腺嘧啶T的类似物，可掺入DNA分子中。BU有两种互变异构体酮式和烯醇式。酮式与A配对，而烯醇式与G配对，这样很容易引起G-C对与A-T对的互相转换。除BU外，5-溴脱氧尿苷（BrdU），5-尿嘧啶，5-氯尿嘧啶及其脱氧核苷。2-氨基嘌呤（2-AP）等都是碱基类似物。第三十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略mispairingATABuGBuGCBumutation碱基类似物诱变机制诱变

第三十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一(二)烷化剂：常用的烷化剂有硫酸二乙脂（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、异丙基甲烷磺酸酯（iPMS）、芥子气类。另外，亚硝基乙基脲烷（NEU）、亚硝基乙基脲（NEH）、亚硝基甲基脲烷（NMU）、乙烯亚胺（EI）、1,4-双重氮乙酰丁烷，也是有效的诱变剂，但是有毒，应用危险，是潜在致癌物质第三十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一(三)嵌合剂：吖啶类染料的分子为平面结构，大小与碱基对差不多，可插入DNA双链核心堆积的碱基对之间，在嵌入的位置引起单个碱基对的插入或缺失，造成移码突变。如口丫啶橙，溴化已啶（EB），原黄素和黄素等。(四)紫外线（UV）:可使DNA产生很多光生成物，如环丁烷嘧啶二聚体。(五)电离辐射：使DNA分子发生氢键断裂，DNA单链或双链断裂，碱基或糖基损伤，DNA，蛋白质相互交联等。x射线，γ射线等，具有较高的能量可引起原子的电离，导致DNA的损伤，基因突变和染色体结构变异。(六)黄曲霉素B1(AFB1)：霉变的花生等食物中含有大量的AFB1，AFB1是一种强致癌剂。可在G的N-T位形成一个加成复合物即产生无嘌呤位点，使GC颠换为T-A，引起基因突变。可导致肝癌。第三十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一其它诱变剂：如亚硝酸、羟胺（NH2OH）、氮蒽、叠氮化钠（NaN3）等物质，均能引起染色体畸变和基因突变。尤其是叠氮化物在一定条件下可获得较高的突变频率，而且相当安全，无残毒。亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。

HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）

HNO2腺嘌呤（A）次黄嘌呤（H）

HNO2鸟嘌呤（G）黄嘌呤（X）这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。第三十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略ATHTHCGCHNO2mispairingmutation化学诱变机制诱变第三十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一基因突变对遗传信息的影响(一）碱基替换的影响：单个碱基替换如果发生在基因编码区，则会改变一个密码子，可以引起蛋白质一级结构中某个氨基酸的变化。

1同义突变(samesensemutation)：由于遗传密码具有简并性。所以有时碱基替换密码子改变但并不改变氨基酸。如GAU→GAC，但仍是天冬AA，无突变效应，密码子的简并性大大削弱了突变的危害性，是DNA的容错机制。

2错义突变（missensemutation）：指碱基替换密码子改变引起氨基酸的改变。错义突变使蛋白质一级结构改变，导致蛋白质活性和功能不同程度的改变。一般性质相似的氨基酸替换对蛋白质的影响小，而性质不同的氨基酸的替换可能强烈的影响蛋白质的功能。

第三十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一3无义突变（nonsensemutation):碱基替换使编码氨基酸的密码子突变为终止密码子，转录出的mRNA在翻译时提前终止，形成的肽链不完全，一般没有活性。形成的终止密码子为UAG、UAA或UGA。

4通读（readingthrough):碱基替换使终止密码子突变为编码氨基酸的密码子，转录出的mRNA在翻译时不能适时终止，直到另一终止密码子为止。

移码突变的影响：在DNA分子的外显子中遗传信息是按三联体密码子排列的，插入或缺失１个或２个或４个碱基会改变阅读框架，结果翻译出来的蛋白质的氨基酸序列也完全改变，但如果插入或缺失３个碱基，则在翻译出的多肽链上只是多或少一个AA，而不会完全打乱AA序列。第三十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一

突变热点和增变基因：理论上，DNA任何位点都可以发生突变，但实际上DNA分子上不同部位有着不同的突变率。

1突变热点：突变率大大高于平均突变率的位点。如５－甲基胞嘧啶（MeC）的存在，MeC脱氨后生成T，不可被校正，而引起突变，C脱氨后变成U，容易被校正。另外一些短的重复系列也易形成突变热点，易发生嵌入和缺失，因DNA复制前模板链与新生链之间的滑动造成。

2增变基因（mutatorgene）：指某些基因突变后可使整个基因组中的突变率明显上升的基因。如DNA聚合酶基因突变，3‘－５’校正功能降低或丧失，是基因突变率升高。另如dam基因突变，则错配修复功能丧失，引起突变率升高。第四十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第四十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第四十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第四十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第四十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一γ射线诱变第四十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略

在基因工程中，T-DNA中的基因被除掉，保留两侧的重复序列，加入欲转移的基因。在用T-DNA诱导突变时，不用加入其它基因。Transpositionandtransposableelements(Ac/Ds)T-DNA插入突变诱变第四十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一Tiplasmid~130bpTDNALBRB正向遗传学策略

TDNA诱变virgenesTDNA插入突变第四十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第四十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一InsertionalmutagenesisbyT-DNA第四十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第五十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一WhenandWhereMutationsHappenIneukaryotes,mutationsthatoccurinthesomaticcells(somaticmutations)arenotinherited;mutationsthatoccuranytimeinthegermlineareinherited.WeusuallymeasuretherateinmutationspergametesomaticmutationgermlinemutationGermlineSoma第五十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一突变体的筛选方法第五十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第五十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第五十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一受细胞核内遗传物质控制的遗传现象，叫做细胞核遗传（核遗传）。细胞核遗传母本父本母本父本正交子代反交子代正向遗传学策略第五十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一细胞质遗传

受细胞质内遗传物质控制的遗传现象，叫做细胞质遗传。母本父本母本父本正交子代反交子代正向遗传学策略第五十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略根据发生突变基因的性质，将众多突变体分成不同的突变系。称为突变体筛选。常用的筛选方法是互补检验（complementationtest）突变体筛选第五十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略互补检验（complementationtest）以豌豆花色为例，野生型为紫色，现有一批突变体花色为白色，它们是相同基因突变，还是不同基因突变？假定突变都是隐性（recessive）突变。突变体筛选第五十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一正向遗传学策略

互补检验假定两个突变体基因型分别为aa

和bb突变体筛选如果a与b是等位基因aaBBAAbb×AaBb紫色wildtype白色mutant如果a与b不是等位基因第五十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一基因组图谱遗传图谱（geneticmap）物理图谱（physicalmap）第六十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一遗传图谱（geneticmap）

采用遗传分析的方法将基因或其它DNA序列标定在染色体上构建连锁图。第六十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一遗传标记有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置。构建遗传图谱就是寻找基因组不同位置上的特征标记。包括：形态标记细胞学标记生化标记DNA分子标记第六十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一多态性（polymophism）所有的标记都必须具有多态性！花色：白色、红色株高：高、矮血型：A、B、O型淀粉：糯、非糯所有多态性都是基因突变的结果！第六十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一形态标记形态性状：株高、颜色、白化症等又称表型标记数量少很多突变是致死的受环境、生育期等因素的影响第六十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一

最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛的形状、颜色，躯体的颜色、翅膀的形状等形态性状作为标记，分析它们连锁关系及遗传距离，绘制而成的。控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就是基因标记。第六十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一果蝇连锁图第六十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一细胞学标记明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征染色体的核型染色体的带型染色体的结构变异染色体的数目变异优点：不受环境影响缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利第六十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一生化标记

又称蛋白质标记就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。

如：同工酶、贮藏蛋白优点：数量较多，受环境影响小缺点：受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息第六十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一DNA分子标记简称分子标记以DNA序列的多态性作为遗传标记优点：不受时间和环境的限制遍布整个基因组，数量无限不影响性状表达自然存在的变异丰富，多态性好共显性，能鉴别纯合体和杂合体第六十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一限制性片段长度多态性

（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）

DNA序列能或不能被某一酶酶切，相当于一对等位基因的差异。

如有两个DNA分子（一对染色体），一个具有某一种酶的酶切位点，而另一个没有这个位点，酶切后形成的DNA片段长度就有差异，即多态性。可将RFLP作为标记，定位在基因组中某一位置上。人类基因组中有105个RFLP位点，每一位点只有两个等位基因。第七十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一RFLP分析第七十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一微卫星（microsatellite）标记微卫星又称为简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR）。这种重复序列的重复单位很短，常常只有2个、3个或4个核苷酸如一条染色体TCTGAGAGAGACGC另一染色体TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就构成了多态性。第七十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一遗传图谱的构建方法

理论基础:连锁与交换基本方法:两点测验法和三点测验法第七十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一植物遗传图谱的构建选择研究材料（亲本）构建分离群体遗传标记检测标记间的连锁分析第七十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一选择亲本

要求亲缘关系远，遗传差异大但又不能相差太大以导致引起子代不育。对备选材料进行多态(差异)性检测，综合测定结果，选择有一定量多态性的一对或几对材料作为遗传作图亲本。第七十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一构建作图群体

第七十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一标记间的连锁分析利用在两个亲本间有多态性的标记分析分离群体中所有个体的基因型根据连锁交换的情况，确定标记之间的连锁关系和遗传距离有计算机软件可以应用第七十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一遗传图谱的缺陷

分别率有限人类只能研究少数减数分裂事件，不能获得大量子代个体测序要求每个标记的间隔小于100kb实际是599kb精确性不够经典遗传学认为，交换是随机发生的基因组中有些区域是重组热点倒位、重复等染色体结构变异会限制交换重组第七十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一物理图谱的构建

用分子生物学方法直接检测DNA标记在染色体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱。有遗传图谱为什么还要构建物理图谱？

遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离〔碱基对(bp)或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)〕的图谱。第七十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一酵母遗传图与物理图比较A遗传图B物理图第八十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一Comparisonofgenetic(likage)andphysicalmapsphysical(bp)genetic(cM)ArabidopsischromosomIV第八十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一基于基因图谱的基因分离技术图谱定位克隆，简称图位克隆（Map-basedcloning)第八十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一1、原理：

利用同源染色体的随机交换和连锁不平衡的原理，先将与某一特定性状相关联的目的基因定位到染色体上，在目的基因的两侧确定一对与目的基因紧密连锁的分子标记，接着将位于两个分子标记间的候选基因DNA片段分离出来，最后再通过遗传互补试验鉴定出目的基因。第八十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一特点：在不知道基因所编码蛋白信息的条件下分离基因。要求：

1、需要构建性状上存在分离的群体；

2、高密度的分子标记图谱进行连锁分析；

3、需要获得与性状紧密连锁的分子标记；

4、高质量的基因组文库；第八十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一植物基因组遗传图谱的构建A、选择亲本B、构建作图群体C、遗传标记的染色体定位D、标记间的连锁分析第八十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第八十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一分子标记(Molecularmarkers)

ADNAsequencethatexistsastwoormorereadilydistinguishedversionsandwhichcanthereforebeusedtomarkamappositiononagenetic,physicalorintegratedgenomemap.即：同源染色体之间DNA序列上的差异，用来表示某个特定的染色体区段。第八十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第八十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第八十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第九十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一Indica(1)Japonica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATG-----------CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATSTSs–Sequencetaggedsites

LeftprimerIndica(40)---------------------------------------------------------Japonica(51)TCCATCTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGIndica(40)----------------------------------------------------------Japonica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGIndica(41)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTJaponica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT

RightprimerInDels:insertionsanddeletions第九十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第九十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一网站网址Supplementalmaterialforthispaper/methods/ppsuppl.htmlNottinghamStockCentre（U.K.）http://nasc.nott.ac.uk/RecombinantInbredmaphttp://nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlOhioStockCenter（U.S.A.）/aims/TAIRdatabase*，homepageRecombinantInbredmap（mirrorsite）/cgi-bin/maps/RiintromapCAPSmarkers/aboutcaps.htmlSequencetable/cgi-bin/maps/Seqtable.plSNPcollection/SNPs.htmlCEREONcollectionofpolymorphisms/cereonSSLPmarkers/SSLP_info/SSLP.htmlTIGR，genomeannotations/tdb/athl/htmls/index.htmlDatabaseofLersequences/tdb/atgenome/Ler.htmlKasuzaDNAResearchInstitute，genomeannotationshttp://www.kazusa.or.jp/kaos/MIPSgenomeannotationshttp://websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINSdatabaseoftransposoninsertionshttp://www.jic.bbsrc.ac.uk/sainsbury-lab/jonathan-jones/jjhome.htm*注：TheArabidopsisInformationResource（TAIR）第九十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第九十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第九十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一Marker1ACAGAGTAGGAGGCAAACGTCGCGCGTAACGTCACGCGTAACGCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC………GCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC………………..GCTACTTACACGGACAPrimerPrimer第九十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一杂合=1-(1/2*1/2+1/2*1/2)10-20MarkerP1P2P1P2PoolPool第九十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一Chr-1Chr-2Chr-3Chr-4Chr-5第九十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一交换率≧50%自由组合交换率＜50%

F1F2第九十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一Marker1Marker第一百页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百零一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一PoolF1PMarker1第一百零二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百零三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百零四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一AGeneBCPCR1….300PCR1….300第一百零五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百零六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一Marker1Marker2第一百零七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百零八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百零九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一RRTargetgeneM1M2RRRRRRRRRRTargetgeneM1M2初步定位精细定位第一百一十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一水稻半矮秆基因sd1的克隆图位克隆法举例1：

水稻半矮秆基因sd1被称为“绿色革命基因”，Monna等人通过图位克隆的方法克隆到，它是编码赤霉素代谢合成途径中一个关键的酶—GA20氧化酶。第一百一十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百一十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一水稻高杆和半矮杆植株第一百一十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一半矮杆IndicajaponicaHabatakiSasanishikiF1正常株高SasanishikiSBIL5MarkerassistedSelection(MAS)Chr1SBIL5F2segregatingpopulation(n=263)第一百一十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一sd-1canbetreatedasamendelianfactorinthispopulation第一百一十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百一十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百一十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百一十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百一十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百二十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一水稻半矮杆基因的精细定位通过对3477个分离单株的分子标记检测（CAPS、SNP等）找到了一个6kb的候选基因区域。第一百二十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一水稻分蘖基因的克隆图位克隆法举例2：理想株型是当前国内外超级稻研究中的一个核心领域，即通过改变水稻在分蘖、茎秆、穗粒等方面的结构特点，提高水稻产量。对于分蘖基因的克隆及机理研究有助于促进水稻秆壮穗大的理想株型的实现，在高产育种中具有重要应用前景。

第一百二十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一水稻分蘖是在基部不延长的节间形成，并独立与主杆生长。水稻分蘖的发生分二个阶段：腋芽形成和生长。第一百二十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一我国李家洋实验室克隆到了控制水稻分蘖的基因MONOCULM1（MOC1）。Themoc1突变体只有一根主杆，没有分蘖，因为不能形成分蘖芽。第一百二十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百二十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一

通过PCR方法将MOC1和moc1基因扩增出，序列比较后发现有一个1.9kb的反向转座因子插入到moc1突变体的ORF中。功能互补试验证明带有完整的ORF和1.5kb上游启动子序列的克隆pC8247能恢复分蘖性状（图1）。但是，C-端截短的克隆pC8247S不能恢复分蘖特性。第一百二十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百二十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百二十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一第一百二十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一总结1、从性状的差异到基因，属于正向遗传学范畴；2、亲本选择性状上存在显著差异的材料，获得性状分离的后代群体；3、亲本选择籼稻、粳稻亚种，便于发展高密度的分子标记；4、通过寻找交换单株来确定紧密连锁的两侧分子标记；5、利用基因组文库或PCR的方法分离获得特殊功能的基因。第一百三十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一存在的问题图位克隆也有其自身的局限性，在某些情况下，就很难或者不能通过图位克隆技术来定位基因。在分析自然发生的变异的时候，我们最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状是由不止一个的基因位点控制的。例如，在Kashmir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之间的杂交实验中，我们发现粉状霉菌抗性基因至少涉及三个遗传位点，它们是以附加的方式起作用的（I.Wilson，C.Schiff，和S.Somerville，个人交流）。对这些抗性基因中的任何一个作精细定位都要求降低作图群体的遗传复杂性，例如通过创造只有一个位点保持多态性的重组近交系。在拟南芥的株系之间杂交时，很多种性状是由一个或多个遗传位点控制的，其中包括开花时间，种子大小，冬眠，生理节律，次生代谢以及表皮毛的密度（综述见Alonso-Blanco和Koornneef，2000）。无论何时，当影响这些性状的自然或者诱导的突变被定位的时候，第二位点修饰成分会干扰这些分析。第一百三十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一表观（上位）遗传突变这个术语是描述一个基因在表达和功能上的可遗传改变，而不涉及DNA序列的改变（综述见Wolffe和Matzke,1999），已有文献很好地证明的是花发育基因SUPERMAN的后生clarkkant等位基因（Jacobson和Meyerowitz，1997）。这些等位基因是可遗传的，但它们不稳定有一个小的回复率。它们在SUPERMAN基因的DNA序列中都具有相似的胞嘧啶甲基化现象，结果，有可能减少了SUPERMAN基因转录子的表达。它们中没有一个是和SUPERMAN的DNA序列改变联系在一起的；尽管如此，它们能被带有SUPERMAN基因的转基因所补充。目前，对于这种表观遗传突变是怎么产生的以及它们出现的频率知道的不多。第一百三十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一关于染色体上位点的物理和遗传距离的比值是变化的。通常这种变化是比较小的，对作图的分辨率也只有较小的影响（Copenhaver等，1998）。但是，有证据表明有些染色体区域是例外的。例如，对GURKE基因的图位克隆就非常困难，这个基因的定位接近于第一条染色体的着丝粒；在着丝粒附近重组是严格限制的，使得对它精细定位的努力非常无效。而且，在这个区域中重复DNA单元的广泛分布使我们辨认出散布的单拷贝序列，这些单拷贝序列能产生有疑问的遗传标记（R.TorresRuiz，个人交流）。这个发现是经过对第二条染色体上的物理和遗传距离之间的比值的系统地分析之后确认的（Lin等，1999）。对这条染色体的几乎全序列，1%重组的遗传距离相当于100~400Kb的物理距离，平均是250Kb。然而着丝粒区域是一个显著的例外，在这里1%重组的遗传距离相当于1000~2500Kb。看来值得指出的是在现存的物理图谱中，拟南芥的五个着丝粒是没有一个被完全覆盖的。最近对着丝粒区域的分析显示这些区域通常包含重复的DNA和几乎不含表达的基因（Copenhaver等，1999）。因此，由于接近着丝粒，应该没有拟南芥基因是不服从图位克隆策略的。第一百三十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一除了着丝粒，第二条染色体上也有一个小片段上1%重组的遗传距离相当于1000Kb甚至更多。根据推测，观察到的低重组率现象可能是由于被用于作图分析的株系的DNA序列的重排（Lin等，1999；Mayer等，1999）。第二和第四条染色体的DNA序列的比较显示有些基因片段是在这两条染色体之间被复制的（其中一个片段的大小是4.6Mb），还有一个从线粒体基因组向第二条染色体转移的DNA片段（Lin等，1999）。这些发现清楚地证明了拟南芥基因组的结构是可以不断改变的。因此，不同株系之间的遗传变异可能不仅仅是由点突变和DNA重排导致的，这就从根本上给图位克隆工程造成了严重的问题。举例来说，如果在两个株系之间发生倒转的一个大约500Kb的序列被用于形成的一个作图群体，所有发生在这个倒转内的重组事件将产生不育的减数分裂产物。因此，不可能在这个倒转序列内对突变进行作图。到目前为止，发生在常见株系之间的这样的DNA重排还没有被报道过，确实应该是这样，因为它们很难被检测到。在一个作图实验中，它们的出现将很有可能被忽视直到最后一步。

第一百三十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一反向遗传学策略

ReverseGeneticsStrategy基因型表现型GenotypePhenotype第一百三十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一反向遗传学策略

已知序列

预测蛋白基因突变

异体表达表达抑制

表现型变化

基因功能技术路线第一百三十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一反向遗传学策略

基因组测序拟南芥、水稻cDNA文库差示法

PCR法探针法

ESTs法其它分子标记法已知序列来源第一百三十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一反向遗传学策略

已知序列来源基因组测序DNAsegmentsGenomeDNAvectorshostReproductionclonesequencing第一百三十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期一YAC-basedphysicalmapofricechromosome1已知序列来源反向遗传学策略

基因组测序第一百三十九页，共一百五十七页，编辑于2023年