感染性疾病课件：病原微生物标本的临床规范化采集、分离和鉴定

病原微生物标本的临床规范化采集、分离和鉴定准确的病原学诊断

针对性病原学治疗

正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提！3社区呼吸道感染致病菌监测肺炎链球菌流感嗜血杆菌卡他莫拉菌金葡菌肺炎克雷伯菌肺炎支原体肺炎衣原体嗜肺军团菌院内呼吸道感染致病菌监测金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌鲍曼不动杆菌肺炎克雷伯杆菌大肠埃希菌嗜麦芽窄食单胞菌种类繁多复杂！新的抗菌药物不断涌现，但感染性疾病的发病率和病死率仍然居高不下。细菌耐药性不断增强—ET/TTESBL肠杆菌科细菌MDR铜绿假单胞菌MDR鲍曼不动杆菌MRSAVRE标本采集与运送标本采集对细菌培养结果的影响时机采集量次数方法标本采集与运送标本运送对细菌培养结果的影响运送时间运送方法采集何种标本PE：左、右大腿多处注射点、多发溃疡、有显著捻发音最有价值的细菌学检测标本血液脑脊液胆汁胸腹水关节液其他无菌体液（尿）或分泌液微生物标本采集原则基本原则：采集标本注意无菌操作避免杂菌污染新鲜标本用抗菌药物之前/<72h确定采集时间、部位和种类注明来源和检验目的

置于无菌容器，不能接触抑制细菌生长物质血培养-采集时机急性高热，在10分钟内在不同部位分别各采集1套血培养，共2套；非急性高热疾病，在24小时内，由不同的部位抽取2-3套的标本；可疑细菌性心内膜炎时，在1～2h内采集3份血标本，如果24h后阴性,再采集3份以上的血标本；不明原因发热，如隐性脓肿,伤寒热和波浪热，可由不同的部位抽取2-3套的标本，每套间隔≧1小时，当培养24至48小时后，若为阴性培养，应再送2-3套。采血前准备：穿工作服、戴口罩、洗手或用速干手消毒液按六步洗手法擦手皮肤消毒用安尔碘（或其它本院批准的消毒液）消毒穿刺点皮肤30秒以上，从穿刺点向外以10cm直径画圈进行消毒；对碘过敏的病人，用75％酒精消毒，消毒60秒，待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血；血培养瓶消毒：用75%酒精消毒血培养瓶橡胶皮塞子，作用60s以上，在血液注入血培养瓶之前，用无菌纱布或棉签清除橡皮塞子表面剩余的酒精。采血量：成人采血量是5～10ml/瓶，儿童1～5ml/瓶。血培养-采集方法血培养-标本的运送和保存血培养采集后必须马上送检，在室温中不得超过2小时，不得放入冰箱冷冻；冷藏？血培养可在一天24小时内的任何时间采集。最有价值的细菌学检测标本血液脑脊液胆汁胸腹水关节液其他无菌体液（尿）或分泌液痰？60%以上实验误差发生在分析前标本质量评估－痰涂片Garbagein！！痰涂片的判定分类 WBC/LF

鳞状上皮细胞/LF5 >25 <104 >25 10-253 >25 >252 10-25 >251 <10 >25分类中1～3类不做培养，要求重新留取标本；

4、5类为合格标本；上呼吸道标本咽后壁拭子鼻拭子鼻咽吸取液下呼吸道标本痰标本自然咳痰、诱导痰经支气管镜采集肺泡灌洗液、保护性毛刷等气管和人工气道吸出物咽拭子患者清水漱口后，由检查者将其舌外拉，用棉拭子将咽后壁或悬雍垂的后侧反复擦拭数次化脓性扁桃体炎、口腔念珠菌病时，直接用棉拭子在病灶部位擦拭插入运送培养基中立即送检，防止干燥注意事项：采用专用拭子拭子应避免触及舌、口腔黏膜和唾液。采集标本前数小时不可用消毒药物漱口或接触病灶局部。将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。两根拭子可浸入同一含2ml转运液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。鼻拭子鼻咽吸取液的收集

1.将吸液管与真空泵相连2.将软管与上腭平行插入鼻孔3.使用真空泵4.缓慢的移出同时轻轻旋转5.使用同一个管子采集另一鼻孔的液体6.收集的液体用3mlVTM冲洗出，放入采样管中痰标本用湿牙刷(勿用牙膏)轻刷口腔黏膜、舌头和牙龈，再用清水或凉开水漱口，戴假牙者取出假牙后漱口，以除去口腔内大量杂菌，用力咳出肺深部的痰液，直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏及不吸水的广口带盖的容器中，标本量应>1ml。咳痰困难者可用3％～10％的无菌盐水25ml雾化吸入，使痰液易于排出。痰标本的采集以晨痰为准，此时患者痰量较多且含菌量也多。标本采集后1～2h内必须立即进行实验室处理，

室温下延搁2h：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌

铜绿假单胞菌对于普通细菌性肺炎，痰标本送检每天1次，连续2～3d。不建议24h内多次采集痰标本送检，除非痰液外观性状出现改变。怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3d清晨痰液送检。深部真菌？

24h内1份；脓性2ml唾液脓痰粘液样痰带血痰痰液操作流程痰液肉眼观察培养前处理涂片检查羊血琼脂平板巧克力平板伊红亚甲蓝/中国蓝或麦康凯琼脂CO2环境需氧培养35℃18-24h观察菌落和涂片染色镜检鉴定试验药敏试验报告时效性：一般需48～72小时，而重症肺炎需要及早针对性治疗在CAP只有30%±病人可获得有意义的痰培养结果采集标本前应用抗菌药物，将降低苛养菌的阳性率在很多情况下难以排除细菌定植或污染常规培养一般分离不到厌氧菌普通痰培养存在的问题经气管穿刺吸引（transtrachealaspiration,TTA）经胸壁针刺吸引（transthoracicneedleaspiration,TNA）经支气管镜采样支气管肺泡灌洗（bronchoalveolarlavage,BAL）经支气管镜直接吸引防污染样本毛刷（protectivespecimenbrush,PSB）开胸肺活检（open-lungbiopsy，OLB）经人工气道吸引分泌物（endotrachealaspirates，ETA）与病理检查相似的微生物标本留取经支气管镜采集肺泡灌洗液（BALF）：是利用纤维支气管镜，对肺段和亚肺段进行灌洗后，采集肺泡表面衬液，适于检测条件致病菌的所有试验。支气管灌洗液：是从主要气道吸出的分泌物，可用于结核分枝杆菌、军团菌和内源性真菌的诊断。王辉.下呼吸道标本的采集运输及处理中应注意的事项.中华结核和呼吸杂志，2012,34(9):650-652.局部麻醉后，通过三腔活塞管在抽吸处注入20mL等渗盐水，用50～100mmHg(1mmHg=0.1133kPa)的负压抽吸收集灌洗液。反复5次，灌入总量100mL，收回40～70mL灌洗液。经支气管镜采集保护性毛刷（PSB）：构造为尼龙刷外套双层塑料管，外套管远端用聚乙二醇作塞封口，可防止采集的标本经过上呼吸道时被污染。标本采集后无菌条件下75%酒精擦洗套管末端3次；将采样毛刷回拉4cm，套管末端0.5cm浸入75%酒精中10～15秒，无菌棉球吸干酒精残液；伸出刷头浸入1ml0.9%生理盐水中，振荡至少60s，标本脱落于液体中可获得稀释103倍的标本，15min内送至微生物实验室或床旁接种。注意事项：应先取支气管灌洗液标本和BALF标本，再取PSB标本和穿刺活检标本，避免将血液带入收集液中，为防止污染，应避免从工作腔中吸取标本。气管和人工气道吸出物仅当临床出现肺炎的症状(发热和肺部浸润)时，将吸出的标本留置于带螺旋盖的无菌杯中。人工气道患者肺部感染病原学诊断有时困难：宿主的气管纤毛黏液防御机制受到损害，大气道常有条件致病菌定植而不再保持无菌状态。细菌浓度≥105CFU/mL可认为是感染，而浓度≤104CFU/mL则认为是污染。呼吸道标本的运送和保存尽快(<2h)送至实验室。不及时运送可导致肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌浓度下降甚至死亡。如不能及时送达，应将呼吸道标本暂存4℃，否则会使营养要求低的细菌如铜绿假单胞菌等过多生长，并影响苛养菌的观测与检出，通常4℃时间不可超过24h。病毒48h以内。避免反复冻融冰上一周也比冻融一次要好胡必杰,魏丽.呼吸道微生物标本的采集和运输.中国呼吸与危重监护杂志,2005，4(4):250-252.被口咽部菌群污染的标本，如咳痰、导痰、经口腔或鼻腔吸引的痰液、气道吸出物和直接经纤维支气管镜吸引的下呼吸道标本均不可用于厌氧菌培养。PSB标本由于避免了上呼吸道正常菌群污染，则可用于厌氧菌培养。临床标本或传染性材料必须有正确的标签、按规定包装并附有详细的检测要求。感染性疾病病原微生物检测方法涂片光镜检查动物接种免疫学检查分离培养与鉴定？涂片光镜检查直接形态学检查诊断感染性疾病病原的最基本和快速的方法各种标本均应制成涂片，革兰染色或特殊染色免疫学检查Figure1.Gramstainof

N.meningitidis

inCSFwithassociatedPMNs.病原微生物生化鉴定各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，代谢产物存在差别。4天后马铃薯葡萄糖琼脂平板培养

血平板及巧克力平板显微镜下乳酚棉兰染色皮肤病理显示皮损处的(PAS)阳性酵母样细胞,有一个细长的萌芽状态。皮肤活检病理沙堡培养基25℃培养结果：

潮湿的,无毛,有皱纹和折叠表面。（颜色可从白至黑不同，可能与培养基中葡萄糖浓度有关）皮损处培养25℃37℃Species-specifi