分枝杆菌实验室的标准化操作

分枝杆菌实验室的标准化操作第1页/共33页直接涂片法步骤竹签茬端，取痰标本中干酪样或脓样部分，玻片右2/3处，均匀涂抹10x20毫米的椭圆形痰膜不可在火焰上加热时涂片！！

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牛牛文库文档分享第3页/共33页不得以火焰加热加速痰膜干燥×

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牛牛文库文档分享第5页/共33页太厚适宜太薄痰膜的厚薄

牛牛文库文档分享第6页/共33页染色（1）玻片放在染色架上，玻片间距保持10毫米以上的距离，染色架下空间足够，方便加热火焰固定（5秒钟将玻片过火4次）滴加石炭酸复红染液，盖满玻片。加热至出现蒸汽，勿使沸腾。脱离火焰，保持5分钟。高海拔地区（西藏、青海）：定期过滤染色液；如室温低则用前热水浴加热染液；火焰加热，由于海拔高、沸点低，需加热多次

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牛牛文库文档分享第8页/共33页染色(2)脱色：

轻缓冲洗沥水。滴加脱色液，保持1分钟。如不彻底，重复。特别说明：脱色时出现油状物时，可能

牛牛文库文档分享第9页/共33页复染滴加亚甲蓝复染液，保持30秒钟流水冲洗，沥去玻片上的水。玻片干燥后镜检

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牛牛文库文档分享第11页/共33页滴加镜油

牛牛文库文档分享第12页/共33页1.接通电源，打开开关

上升聚光镜至最高，调节光圈70－80％大小

2.将涂片放在载物台上，痰膜朝上

牛牛文库文档分享第13页/共33页显微镜检查读片时，首先从左至右观察；纵向向下转换一个视野；然后从右向左观察

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结果报告 阴性 未发现抗酸菌/300视野

报告实际菌落数 1-8条/300视野 (1+) 1-9条/100视野(2+) 1-9条/l0视野 (3+) 1-9条/每视野 (4+) 达到或超过10条/每视野

牛牛文库文档分享第16页/共33页分枝杆菌培养培养基质控前处理接种和孵育结果和报告

牛牛文库文档分享第17页/共33页原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌原则：

-尽可能杀灭标本中的杂菌

-尽可能保存标本中的分枝杆菌标本前处理

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前处理的步骤：

取1－2ml痰标本至前处理管视标本性状加入1－2倍体积的4％氢氧化钠震荡30－60秒至标本完全液化室温静置15分钟（整个处理时间不得超过20分钟）

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操作

痰标本1－2倍4%NaOH振荡匀化静置15分钟

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前处理的注意事项：标本留取后4℃保存、尽快处理选择标本中脓性、血样、干酪样的部分进行培养避免弱处理和过处理

-前处理液的浓度

-处理时间避免交叉污染－－－先阴性、再低涂阳、后高涂阳吸取标本、加液、涡旋震荡时可能产生危险气溶胶

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37℃竖直培养8周均匀接种0.1ml,2支/标本斜面向上，37℃水平放置24小时接种和孵育

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接种的注意事项：培养基斜面的背面标注（标本号、姓名、接种日期）标本应尽可能布满斜面避免污染：

-使用灭菌的移液管

-无菌手法操作

-接种后避免液体流至瓶口、瓶盖接种量：0.1毫升（2滴）可能产生危险气溶胶

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孵育的注意事项：

接种后斜面向上孵育24小时之后培养基直立继续孵（检查瓶盖是否拧紧）温度监测

光线的影响－避免使用可视窗的温箱

牛牛文库文档分享第24页/共33页接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况此后每周观察一次，直至满8周每次观察记录菌落生长及污染情况四、结果的观察与报告

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满8周后未见菌落生长，可报告分枝杆菌生长阴性，培养管高压后丢弃；发现显著污染以至无法观察结果，记录“污染”，培养管高压后丢弃；发现疑似分枝杆菌生长，将培养管冷藏保存，报告省参比实验室，待其收取。

牛牛文库文档分享第26页/共33页报告方式分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。

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结果报告的注意事项：

必须记录生长过程,不得只记录最终结果不得打开培养管进行操作发现可疑分枝杆菌生长时尽快送药敏试验室阴性培养管也要高压后丢弃

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培养的质量控制：

培训和预培养人员、房间、设备固定培养基统一提供

牛牛文库文档分享第29页/共33页结核分枝杆菌的生长要求：

专性需氧菌最适PH为6.5～7.2温箱设定温度为36℃,温度范围35－37

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牛牛文库文档分享第31页/共33页小结–操作流程

涡旋振荡1分钟痰标本中加入1-2倍体积4%N