生化与分子生物学技术：口腔粘膜细胞基因组DNA制备

生化与分子生物学技术学习要求掌握的主要内容核酸技术（提取，纯化，鉴定）蛋白质技术（提取，纯化，鉴定）其他基本要求离心技术，电泳技术，分光光度技术加样，染色，各种试剂的使用实验室秩序（时间，物品保管，工作服，分组与值日）仪器与设备的使用实验室安全、环保实验室管理与操作规程本次实验安排口腔粘膜基因组DNA的提取与纯化apoB基因PCR加样与上机

基因组DNA的提取与纯化目的：基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。核酸分离纯化的基本原则：保证核酸一级结构完整排除其他分子的污染蛋白质、脂类、糖、有机熔剂、金属离子、外源DNA、RNA等

核酸提取的主要步骤破碎细胞：

SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出注意事项减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融；高温等）防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）人基因组DNA的制备实验目的及意义

1.从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA2.掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理基因组DNA提取原理

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。实验材料及试剂材料：人口腔上皮细试剂：抽提缓冲液：Tris-ClpH8.0，EDTA，

NaCl，RNAaseSDS，蛋白酶K，饱和酚氯仿/异戊醇（24:1）

75%及95%乙醇

TE缓冲液：Tris，EDTA主要试剂的功能抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成.SDS:裂解细胞.EDTA:络合镁钙等二价金属离子,防止

DNA酶对DNA分子的降解作用。蛋白酶K：水解蛋白质。酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA实验步骤及注意事项（一人一组）：取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，取10ml含漱用10ml离心管（4000rpm

10min）收集细胞沉淀

（台式离心机的使用，平衡，视频：离心技术）

加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至1.5mlEP管，

（微量移液器的正确使用）

混匀，65℃温育10min加入等体积的饱和酚(0.5ml)，充分颠倒混匀

（不要震荡！注意饱和酚的性状！）12000rpm5min，上层水相转移至新的EP管

高速离心机的使用与安全意识

加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀12000rpm5min，上层水相转移到新的EP管

加入2倍体积95%的乙醇，颠倒混匀12000rpm5min

弃上清，沉淀中加入75%乙醇12000rpm2min

轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置5~10min加入30l0.1×TE溶液4℃保存

实验结果及其分析定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳定量分析：紫外分光光度法测定

DNA溶液的浓度常见问题：

1.提取的DNA不纯：变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。

2.提取的DNA成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。

3.与细胞器DNA分离不全；变性过程不完全；试剂配置问题。apoB(用个人基因组DNA为模板）混合液引物ddH2O12.5μl2ul6.5ulDNA模板4μl总体积：25μl

94℃5min（预变性）

94℃1min（变性）

60℃4min退火+延伸（30个循环）

60℃5min（续延伸）

4℃保存PCR加样表PCR程序微量加样枪使用程序及注意事项第一步:看整体操作按钮容量刻度套头第二步:看大小调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏。20l1000l100l100100200调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏

0.5--10l20--200l100--1000l10.02001000第三步:学调节调节钮切记:

看着刻度调大小刻度第四步:学使用一挡吸取二挡排放切记:第五步:学维护1调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏。2切勿自行拆卸加样枪

3对腐蚀性及毒性试剂等注意防范。1每次实验课前主管技术员检查确认加样枪完好后交带教老师签名领取。2带教老师检查确认加样枪完好后按编号交各组学生使用。3学生使用完后按编号交回带教老师。4带教老师确认加样枪完好后交主管技术员检查签收。微量加样枪使用程序关于apoB基因独立于2号染色体短臂末端，编码apoB蛋白质全长43kb(28