抗体,胶乳基本偶联步骤

试剂准备：MES缓冲液500mM,pH5-6,4°C储存；EDAC配置浓度为52pmol/mL（称取10mgEDAC，加入1mL去离子水）；NHS配制浓度为50mg/mL水溶液；蛋白质溶液缓冲液稀释至浓度为1—10mg/mL。二步偶联法：将配好的溶液按以下顺序滴加入离心管100pL500mMMES缓冲液；加水稀释至1mL；200pL5%微球；230uLNHS溶液EDAC水溶液（计算量）放置在恒温摇床上，37C,120rpm,30min；13000rpm离心30min，沉降后，弃上清，收集离心沉淀；用1mL50mMMES缓冲液洗涤2次；离心沉降后，弃上清。将配好的溶液按以下顺序加入离心管中，混匀100ul500mMMES缓冲液；加水稀释至1mL；蛋白质溶液。放置在恒温摇床上，37C，120rpm，2h；13000rpm离心20min沉降后，弃上清，收集离心沉淀;用1mL50mMMES缓冲液（或者调节pH至8.0左右），同时加入BSA溶液至其终浓度为1%,洗涤3次；离心沉降后，弃上清。加入0.97mLMES缓冲液（或者调节pH至8.0左右），将微球浓度调为1%，并重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散；重新悬浮后加入一定量的BSA溶液（比如终浓度为1%），保存。福林酚法测定偶联蛋白质含量（可选）。（如要测蛋白质含量，则前面的方法中不可加入BSA。）每ml反应混合物加入以下成分：加入DIW，定容最终体积为1ml；0.1ml10X的MESbuffer，ph6.0〜6.5（10X的buffer通常用0.5M）；0.1ml10%的微球（终浓度为1%）；0.23mlNHS水溶液（50mg/mL）;11.5mg一定体积的19.2mg/ml（100mM）的EDAC水溶液；室温下搅拌反应15〜30min；（Note7）清洗：MESbuffer或DIW清洗两次；（Note3）；用MESbuffe或者DIW悬浮微球到浓度为1%；同时，用MESbuffer溶解稀释抗体。buffer一般为ph7〜9，50mM〜100mM。最终的蛋白浓度1mg/mL;清洗完微球后，立即加入一定体积的抗体溶液。（Note2）。（注意:此处给出的例子，微球浓度和蛋白浓度和buffer分别为0.5%（w/v），0.5mg/mL，25〜50mM）;室温下搅拌孵育2hr；每ml反应液中加入2.5ml乙醇胺，室温搅拌孵育10〜30min；清洗：MESbuffer清洗两次离心去除上清，重新悬浮微球，然后搅拌，接着温和的超声分散（加入一定量的BSA）。（Note3/4）1、取0.1ml胶乳微球，加入0.9ml,0.1mol/L,PH6.0的MES混合。2、向上述混合液中加入EDC和NHS各5mg活化，室温下温和搅拌15min,10000r/min离心15min,用0.1mol/LPBS重复洗涤3次，去上清，沉淀后经0.1mol/LPBS重悬、振荡、超声处理后得到活化的胶乳微球。3、取40ul待偶联抗体(10mg/ml)加入到1ml经过活化的胶乳微球溶液中，室温下温和搅拌4h，10000r/min离