2022年医学专题-检测CD4CD8T淋巴细胞的意义续

CD4T淋巴细胞检测(jiǎncè)标准及要求毛爱玲山西省性病(xìngbìng)艾滋病监测中心第一页，共五十六页。第二页，共五十六页。HIV在人体内(tǐnèi)的复制1.吸附及穿入：gp120+CCR5→GP41和膜融合→核衣壳穿入宿主细胞2.脱衣壳和逆转录：P24+亲环素→出壳→RNA依赖的DNA聚合酶→逆转录→cDNA3.环化：cDNA→双链环状DNA

4.整合：双股DNA整合入宿主细胞染色体DNA中→前病毒5.转录：前病毒DNA→RNA→mRNA6.翻译与装配：Gag蛋白与病毒的RNA结合装配成核壳体。7.病毒成熟、出芽：芽生方式(fāngshì)释放第三页，共五十六页。第四页，共五十六页。AIDS发病(fābìng)机理

HIV侵入人体后主要攻击(gōngjī)的是一种带CD4抗原的淋巴细胞（T4淋巴细胞）。这种细胞是免疫系统的基本组成部分，HIV通过大量、不断地复制与释放，导致T4淋巴细胞进行性下降，感染者免疫功能遭到严重破坏，造成免疫缺陷。临床表现为各种各样机会性感染与肿瘤。第五页，共五十六页。AIDS发病(fābìng)机理HIV进入人体后能选择性地侵犯有CD4受体的淋巴细胞，当病毒颗粒(kēlì)释放出来后，继续攻击其他CD4T淋巴细胞。大量的CD4+T淋巴细胞被HIV攻击后，首先引起细胞功能的障碍。HIV病毒在细胞内大量繁殖，导致细胞的溶解和破裂。第六页，共五十六页。AIDS发病(fābìng)机理3.HIV在细胞内复制后，以芽生方式释出时可引起细胞膜的损伤。由于HIV可抑制细胞膜磷脂的合成从而影响细胞膜的功能，导致细胞病变(bìngbiàn)。4.HIV还可以感染骨髓干细胞导致CD4+T淋巴细胞减少。第七页，共五十六页。AIDS发病(fābìng)机理5.当受HIV感染的CD4+T淋巴细胞表面存在的gp120发生表达后，它可以与未感染的CD4+T淋巴细胞CD4分子结合，形成融合细胞，从而改变细胞膜的通透性，引起细胞的溶解和破坏。6.游离(yóulí)的gp120也可以与未感染的CD4+T淋巴细胞结合，作为抗体介导依赖性细胞毒作用的抗原，使CD4+T淋巴细胞成为靶细胞，受K细胞攻击而损伤。第八页，共五十六页。AIDS发病(fābìng)机理HIV感染后一般首先出现CD4T淋巴细胞轻度至中度降低，该细胞总数(zǒngshù)可持续数年不变，反应病毒为免疫应答所抑制。历经一段时间后，CD4+T细胞逐渐进行性下降，表明病毒逐渐逃脱了免疫应答的控制。当CD4+T淋巴细胞一旦下降至200细胞/μl或更低时，则就可出现机会性感染。第九页，共五十六页。HIV感染的三种(sānzhǒnɡ)结局典型(diǎnxíng)进展者：8-10年内免疫功能逐渐下降，最后发展成为艾滋病。快速进展者：CD4+细胞计数在2-5年内迅速下降，抗HIV抗体水平很低，HIV感染后有较高的病毒载量。长期存活者（长期不进展者）：感染后维持健康状态12年以上，且CD4+计数维持正常。第十页，共五十六页。HIVinfectionJ.Coffin,XIInternationalConf.onAIDS,Vancouver,1996艾滋病的病程就象一列迫近悬崖的火车病毒载量=火车的速度CD4计数(jìshù)

=离悬崖的距离第十一页，共五十六页。第十二页，共五十六页。从HIV感染(gǎnrǎn)发展到艾滋病HIV一旦进入人体，这个人就成为HIV感染者。经过急性感染期﹑潜伏期，以后(yǐhòu)逐渐发展成艾滋病病人。处于潜伏期的感染者免疫功能没有受到严重破坏，因而没有明显的临床症状。从感染者到艾滋病病人这段潜伏期时间的长短与感染途径﹑感染病毒的数量﹑感染者的年龄、生活条件、心理、生理状况等多种因素有关，短则几年，长则20年。发达国家较长，发展中国家短些。资料表明，经输血传播的潜伏期较短，经性接触传播的潜伏期较长。第十三页，共五十六页。检测(jiǎncè)CD4、CD8T淋巴细胞的意义淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一群细胞，在正常机体内各淋巴细胞亚群相互作用，维持机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。因此，T淋巴细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状态的重要信息。AIDS是由HIV引起的一组综合症，HIV主要侵犯人CD4T淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破造成(zàochénɡ)免疫功能低下，最终导致各种机会感染和肿瘤第十四页，共五十六页。检测(jiǎncè)CD4、CD8T淋巴细胞的意义(续)CD4T淋巴细胞绝对值的检测在HIV感染和艾滋病病人治疗(zhìliáo)以及病毒治疗(zhìliáo)疗效方面发挥了重要的作用1.了解机体的免役状态以确定疾病分期2.监测疾病进程3.评估疾病预后4.制定抗病毒治疗及机会性感染预防性治疗方案评估抗病毒药物疗效第十五页，共五十六页。检测(jiǎncè)CD4、CD8T淋巴细胞的意义(续)因而，对HIV感染者和AIDS病人定期进行CD4、CD8T淋巴细胞检测具有十分(shífēn)重要的意义。美国疾病预防控制中心就是以此为基础制订了HIV感染者/AIDS病人的诊断和分类标准，目前国内外仍被采纳应用。第十六页，共五十六页。规范(guīfàn)的AIDS治疗

目前我国HIV治疗范围逐渐扩大，国家示范区大批的治疗已经开始。我省也于2004年启动了对AIDS的治疗。但是(dànshì)由于检测费用昂贵，大批治疗中50%以上病人不进行规范检测.一旦出现耐药病人，后果将不堪设想。所以规范的实验室检测是非常重要的一个环节。第十七页，共五十六页。实验室条件

1.人员

进行HIV感染者和病人CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全(ānquán)及实验操作技术培训。第十八页，共五十六页。实验室条件(续)

设施和设备(shèbèi)

样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转震荡器、精确移液器（5ul~50u1、20u1~200u1、200u1~1000u1)。流式细胞仪检测区：流式细胞仪第十九页，共五十六页。实验室条件(续)

功能分区

实验室应分为样品处理区和流式细胞仪检测区，各区的功能是：样品处理区应达到生物安全(ānquán)Ⅱ级实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。第二十页，共五十六页。方法目前用于CD4和CD8T淋巴细胞计数的检测方法分为自动检测方法和手工操作法。自动检测方法包括流式细胞仪（主要有多平台(píngtái)三级程序法和单平台(píngtái)一步法）和专门的细胞计数仪。手工操作法包括几种手工操纵试验，需要显微镜或酶联免疫试验设备。第二十一页，共五十六页。方法检测CD4T淋巴细胞数的标准方法为流式细胞仪，可得出CD4,CD8等淋巴细胞及比值(bǐzhí)。为确保检测的准确性，应建立内部质量控制及参加国家室间评价。第二十二页，共五十六页。流式细胞仪(FACSCalibur,BD)第二十三页，共五十六页。简易(jiǎnyì)流式细胞仪器（FACSCount,BD)第二十四页，共五十六页。免疫(miǎnyì)指标的检测CD4/CD3CD8/CD3CD3CD4/CD8第二十五页，共五十六页。全省CD4流氏细胞(xìbāo)仪分布山西省艾滋病确证(quèzhènɡ)中心实验室运城市艾滋病确证实验室临汾市艾滋病确证实验室太原市艾滋病确证实验室大同市艾滋病确证实验室长治市艾滋病初筛中心实验室第二十六页，共五十六页。CD4细胞样本采集(cǎijí)﹑运送﹑检测要求第二十七页，共五十六页。1.成功的临床治疗效果评定依赖于有保障的标本采集、保存、检测，以及数据处理等等。在研究前期就要有计划的设计研究项目，确定所需要(xūyào)的标本类型。比如：所有的血液标本是否需要(xūyào)抗凝处理、是否需要(xūyào)无菌等

标本采集的要求第二十八页，共五十六页。标本(biāoběn)采集的要求(续)

2.采集的标本应该长期保存，至少要求保存至此项目完成。血液标本可用于CD4T淋巴细胞、抗原、抗体检测，病毒分离(fēnlí)，PCR检测.3.血液标本应尽量在24小时内处理，尤其是CD4T淋巴细胞检测、病毒分离，PCR检测.第二十九页，共五十六页。标本的采集(续)

选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。用于血液学检测的抗凝剂⑴K3EDTA（1.5±0.15mg/ml血液)。⑵枸橼酸钠

(3)肝素在血球分析仪生产商允许的时间(shíjiān)范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。用于流式细胞仪的抗凝剂主要是K3EDTA

第三十页，共五十六页。标本(biāoběn)的采集第三十一页，共五十六页。

标本的采集采集用品(yòngpǐn)采血管真空、负压抗凝（EDTA或枸橼酸钠）无菌针头蝶形针头第三十二页，共五十六页。采集用品：采血套管固定采血管位置(wèizhi)，方便操作；保护操作者的安全注意：切勿将采血针头的套管(tàoɡuǎn)回套！注意采血后器具的放置、消毒、处理

标本的采集(续)第三十三页，共五十六页。标本(biāoběn)的采集(续)

采血后应立即握住试管两端，颠倒混匀多次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。准备适当数量(shùliàng)的样品管当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型检测在同一实验室内进行时，用一个装有K3EDTA的试管即可。对所有样品编号，并写明日期和时间。第三十四页，共五十六页。

标本的运输在标本运输过程中，应确保标本能够及时、准确运输到指定地点。要求提前与对方(duìfāng)联系，确定时间，对方(duìfāng)应提前做好相关实验的准备工作，尽快进行标本处理运输的所有标本都应有送检单给接受样品的实验室。每张送检单都应详细填写所要求的内容.第三十五页，共五十六页。样品的运输运送(续)尽可能快地将样品送至免疫表型检测实验室。如需运送样品到其它地点时，应将装样品的试管放于一个(yīɡè)防漏的容器中，并将此容器放于一个(yīɡè)装有吸水性物质的指罐中，以防止震动并可吸收所有试管破裂漏出的血液。盖紧指罐，用橡皮带系紧。应选择特定的方案，并且安排合适的时间和运输样品。第三十六页，共五十六页。样品的接收

样品到达以后立即检查试管及其所装的血样。不可检测溶血或结冰样品。不可检测凝血和乳糜的样品。如果样品的采集时间已超过(chāoguò)48H，不于接收.第三十七页，共五十六页。

标本的处理一般(yībān)采集HIV-1感染者全血10-20ml

血浆(xuèjiāng)（含有血小板）淋巴细胞层红细胞层1．

抗

凝

2．

无

菌3．

室

温4．

24h内处理第三十八页，共五十六页。实现CD4,CD8,CD3绝对(juéduì)计数FACSCount结果可信度：绝对计数质控内置错误自动(zìdòng)报警第三十九页，共五十六页。FACSCount内置微处理器实现数据(shùjù)自动分析自动打印质控与病人(bìngrén)的检测结果简单(jiǎndān)易用的系统控制面板配套的样本制备工作台样本制备方法简捷，避免细胞损失第四十页，共五十六页。FACSCount试剂(shìjì)与对照FACSCount工作台FACSCount–完善(wánshàn)的系统第四十一页，共五十六页。每管加入50ml全血加入，混匀，室温避光孵育1h无需溶血1每管加入50ml固定液，混匀，室温避光孵育30min无需离心洗涤2FACSCount上机检测.无需血球计数仪，直接得到绝对值结果33步测定CD4,CD8，CD3绝对(juéduì)计数第四十二页，共五十六页。预配试剂(shìjì)FACSCount–完善(wánshàn)的系统第四十三页，共五十六页。FACSCount–完善(wánshàn)的系统检测试剂盒组成（50人份/盒）荧光试剂(shìjì)2个组合/人份CD4PE/CD3PE-CY5CD8PE/CD3PE-CY5固定液效期2—80C储存6个月第四十四页，共五十六页。FACSCount–完善(wánshàn)的系统质控试剂盒（50人份/盒）零，低，中，高4种靶值微球效期2—80C储存(chǔcún)1个月第四十五页，共五十六页。FACSCount3步测定CD4,CD8，CD3绝对(juéduì)计数第四十六页，共五十六页。每管加入50ml全血加入，混匀，室温(shìwēn)避光孵育1h无需溶血1FACSCount第四十七页，共五十六页。FACSCount每管加入50ml固定液，混匀，室温避光孵育30min无需离心(líxīn)洗涤2第四十八页，共五十六页。FACSCount上机检测.无需血球计数仪，直接(zhíjiē)得到绝对值结果3FACSCount第四十九页，共五十六页。打印结果对照病人(bìngrén)标本FACSCount–分析(fēnxī)第五十页，共五十六页。实验(shíyàn)资料的记录实验应及时、准确地记录结果。实验记录中应包括以下内容：日期、操作者、所有样品(yàngpǐn)、实验内容、过程（步骤）、结果及有无事故等。整个实验室的实验资料要统一有专人负责，按固定格式记录在案。计算机生成的实验结果，存档备案：定