CASE基因治疗课稿

CASE基因治疗课稿第1页/共49页肝癌的自杀基因（suicidegene）疗法，即药物敏感基因（drugsensitivity)疗法，分子化疗、病毒导向的酶解药物前体疗法（VDEPT）、基因导向的酶解药物前体疗法（GDEPT），是将病毒、细菌中特有的前药物转换酶基因——自杀基因导入到肿瘤细胞，自杀基因编码的特异性酶类将无毒的药物前体在肿瘤细胞内代谢成毒性产物达到杀伤肿瘤细胞的目的。自杀基因治疗第2页/共49页自杀基因类型单纯疱疹病毒—胸苷激酶基因（HSV—TK）水痘带状疱疹病毒—胸苷激酶基因（VZV—TK)大肠杆菌胞嘧啶脱氧酶基因（EC—CD）第3页/共49页单纯疱疹病毒—胸苷激酶基因（HSV—TK）单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus）胸苷激酶（thymidinekinase）基因能特异性地将核苷类似物无环鸟苷（ACV）或丙氧鸟苷（GCV）单磷酸化，进而在肿瘤细胞内代谢成三磷酸GCV。这种高毒性的GCV是细胞DNA聚合酶的抑制子和DNA合成的终结子，使分裂的肿瘤细胞被杀伤。第4页/共49页HSV-TKACVOPO3磷酸化后的ACV第5页/共49页水痘带状疱疹病毒—胸苷激酶基因（VZV—TK)

水痘带状疱疹病毒（varicellazostervirus）胸苷激酶，可将无毒的甲基嘌呤阿拉伯核苷（araMP）代谢成DNA酶的抑制物腺阿拉伯三磷酸（araATP），从而杀伤肿瘤细胞。第6页/共49页大肠杆菌胞嘧啶脱氧酶基因（EC—CD）可将抗真菌药物5-氟胞嘧啶（5-Fc）转化为高细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）此外，还有大肠杆菌脱氧胞苷激酶（deoxycitidinekinase）基因，大肠杆菌鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（gunainephosphoribosyltransferase)基因等。escherishiacolicytosinedeaminase第7页/共49页第8页/共49页现状

其中研究最深入，应用最广泛的仍是HSV-TK/GCV系统，VZV-TK/araM系统，FC-CD/5-Fc系统。其中HSV-TK/GCV系统的抗肿瘤效能已在多种肿瘤的体外实验中得到确证。第9页/共49页第10页/共49页

自杀基因杀死肿瘤细胞的作用机制1.直接杀伤作用

2.旁观者效应

3.诱导机体免疫第11页/共49页自杀基因的旁观者效应现象：体外实验发现，转染HSV-TK（TK+)基因和未转染HSV-TK（TK-）基因混合培养时，GCV不仅杀死TK+细胞，而且杀死TK-细胞。而且肿瘤细胞培养中只要有10%的TK+基因细胞就可使其他未转染HSV-TK（TK-）基因细胞同时被杀伤。意义：只要少数的肿瘤细胞被转染自杀基因，就会对临近的肿瘤细胞产生广泛的杀伤作用（这样也可以减低对转染方法效率的要求，有很大的临床应用价值）第12页/共49页旁观者效应的途径①转导自杀基因的肿瘤细胞前体药物代谢产物可直接传递到邻近的细胞，使邻近的细胞死亡②转导自杀基因的肿瘤细胞的死亡是一种凋亡，细胞凋亡后凋亡小体能够转移一些毒性产物和自杀基因表达酶本身进入邻近的细胞，引起继发性的凋亡。第13页/共49页免疫介导作用1.自杀基因诱导的细胞死亡,凋亡,坏死以及细胞核降解所释放出的大量细胞碎片,增强了机体对肿瘤抗原的递呈和T细胞的识别2.递呈抗原活化的CD8+通过直接杀伤和指导中性粒细胞释放细胞因子来发挥最大的细胞毒作用3.CD4+细胞的抗肿瘤记忆作用,共刺激分子B7,MHCⅠ类分子,NK细胞以及其他非特异性杀伤细胞也参与了自杀基因介导的抗肿瘤效应第14页/共49页自杀基因的载体

将自杀基因载体转导至肿瘤靶细胞所用载体是自杀基因疗法付诸于临床的一项关键技术。肝癌自杀基因疗法采用⑴重组逆转录病毒载体⑵腺病毒载体

第15页/共49页重组逆转录病毒载体

逆转录病毒载体能携带外源基因整合到靶细胞基因组，实现目的基因持久稳定表达。逆转录病毒载体只在分裂细胞中整合，因此对肝癌细胞相对带有靶向性，但它的转染滴度较低并有插入突变和激活癌基因的危险，所以不适合直接体内基因转导。第16页/共49页腺病毒载体

腺病毒载体能产生更高的病毒滴度及在体内外对肝癌细胞有较高的转染效率。不整合人宿主染色体基因组，安全性稳定。但是腺病毒载体在转染后会产生免疫反应进而降低转染效率进而限制重复使用。第17页/共49页基因转导与表达的靶向性

可以将自杀基因置于特异性转录调控序列之下，达到使自杀基因在肝特异性表达癌组织第18页/共49页抑癌基因P53基因P27基因P21基因P16基因（MTS1）甲状腺素蛋白（TTR）PTENKLF6第19页/共49页P53p53基因位于染色体17p13.1，是一种肿瘤抑制基因，近半数的原发肿瘤与p53突变有关，包括30%～60%的肝癌。p53突变通常发生在体积大、低分化的肝癌，并且提示预后不良。p53基因突变本身并不直接引发肝癌，但会促进肝癌的发展。肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)第20页/共49页p53的等位基因缺失和准时突变集中于外显子4和外显子9之间包含有DNA结合域的编码区。第21页/共49页当DNA受到损伤时,P53蛋白在细胞核内积累,DNA复制停止,细胞周期停滞在G1期,为DNA的修复留有充足的时间.如果修复失败,P53蛋白则引导细胞进入程序性死亡.当p53发生突变时,不仅丧失此功能,而且还转为癌基因。第22页/共49页由于不能产生这个蛋白来与p53基因产物作用,一旦进入细胞后,该病毒不能有效的繁殖。而在p53基因突变的肿瘤细胞中,由于p53基因蛋白功能的缺失,缺失E1B-55KD基因的腺病毒可以不受抑制,在细胞中有效繁殖,故而杀死宿主肿瘤细胞。第23页/共49页P53突变不仅丧失阻止细胞周期和DNA损伤时诱导凋亡作用,而且突变体有获得性功能,如激活PCNA、VEGF、EGFR、IGF1受体,激活CMYC、MDR基因等,P53突变导致化疗药物诱导细胞凋亡作用显著下降,用P53反义核酸治疗,可以抑制肿瘤的增殖,诱导凋亡,提高药物的敏感性。第24页/共49页PTEN抑癌基因PTEN(phosphataseandtensinhomologdeletedfromchromosome10,PTEN),又称为MMAC1(mutatedinmultipleadvancedcancers,MMAC1),是1997年发现的一种抑癌基因,定位于人染色体10q23。它是迄今发现的惟一一种能使脂类去磷酸化的抑癌基因,而且,其抑癌作用依赖于这种特性。PTEN是继p53基因之后发现的人类肿瘤中最常突变的抑癌基。第25页/共49页PTEN的结构可大体分为三个功能区，包括N端磷酸酶结构域，C端结构域和一个与脂质结合的C2区。第26页/共49页PTEN具有两种磷酸酶活性：1.脂质磷酸酶活性2.蛋白磷酸酶活性PTEN能够使粘着斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)和接头蛋白Shc去磷酸化，抑制细胞转移及浸润，同时抑制MAPK(促细胞分裂素激活的蛋白激酶)信号传导通路来抑制细胞分化。第27页/共49页PTEN的作用机制三种：1.三磷脂酰肌醇途径（PIP3途径）2.FAK途径3.丝裂原激活的蛋白激酶途径（MAPK途径）

第28页/共49页三磷脂酰肌醇途径（PIP3途径）脂质PIP3是一种全新的磷酸酶作用的靶分子，位于细胞膜上，是细胞生长因子的信号转递分子。PTEN编码的蛋白具有脂质磷酸酶的活性，可使PIP3去磷酸化，阻止PI3K调控的生长因子信号转导通路，降低PIP3水平而使细胞停止于G1期，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

IsabelleOpitz等研究PTEN的表达缺失与间皮瘤的关系时，证明其与PI3K-AKT/PKB通路有关。merH.Yilmaz,SeanJ.Morrison研究表明，抑制PTEN可以在PI3K/AKT通路对白血病肿瘤细胞和正常造血干细胞产生相反的影响。第29页/共49页FAK途径局灶黏附激酶(focaladhesionkinase,FAK)几乎位于所有细胞的细胞膜，介导细胞与细胞外基质的黏附。整合素通过与细胞外基质作用而被活化，导致FAK酪氨酸磷酸化水平增高，并增加其磷酸激酶的活性，FAK再作用于丝氨酸、苏氨酸激酶(MAPK)和磷酸酶，最终导致某些关键因子磷酸化水平的改变及相关基因的表达。第30页/共49页丝裂原激活的蛋白激酶途径（MAPK途径）丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)可激活促细胞分裂素，介导有丝分裂信号向胞核传导，调控细胞生长。PTEN能抑制MAPK途径上游中的细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)、RAS的活化以及Shc的磷酸化，从而对ERK/MAPK信号途径起负调节作用，而且PTEN基因还能抑制MAPK激酶的磷酸化，阻滞细胞生长周期于G1期，抑制肿瘤细胞生长。SukmiKang-Park等研究表明，在HCC形成过程中，PTEN通过阻断PKC，MAPK以及MAPK激酶，最终降低IGF-II的表达。第31页/共49页p16p16，又称MTS1(mulitipletumorsuppressergenel)，在细胞周期调控中起负性调节作用，防止细胞过度增殖，是一种与凋亡相关的肿瘤抑癌基因。HCC组织中存在p16基因的异常及p16蛋白的表达缺失，p16在HCC的致病机制中发挥重要作用。p16基因的异常包括基因突变、杂合性缺失和纯合性缺失、基因的高甲基化。第32页/共49页p16基因突变与HCCp16基因缺失与HCCp16甲基化与HCC第33页/共49页转甲状腺素蛋白（TTR）在人原发性肝癌中,转甲状腺素蛋白（TTR）基因转录严重受阻遏。转甲状腺素蛋白又称为前白蛋白（prealbumin,PA）,维生素A转运蛋白，分子量大约为54kD，由4个相同的亚单位组成。TTR主要由肝细胞合成。在肝实质受损伤的机型肝炎、慢迁肝炎等病人血清中TTR含量明显降低，肝损伤越严重，降低越明显。在肝实质损伤不明显的原发性肝癌病人血清中TTR含量也明显下降。第34页/共49页TTR的突变与中暑圣经系统的广泛淀粉样病变相关，TTR的突变与原发性肝癌相关，发现了在原发性肝癌中TTR低表达，但在正常肝中高表达。第35页/共49页免疫基因第36页/共49页免疫基因治疗肿瘤是应用分子生物学的方法,将与免疫有关的细胞因子基因导入肿瘤或其他免疫效应细胞,使其在机体表达分泌细胞因子或利用其基因增强肿瘤细胞的免疫原性和(或)免疫系统的功能。肿瘤的免疫基因治疗,可获得细胞因子肿瘤局部的高表达。第37页/共49页细胞因子基因导入效应细胞细胞因子基因导入肿瘤细胞共刺激分子导入肿瘤细胞主要组织相容复合体(MHC)基因导入肿瘤细胞第38页/共49页细胞因子基因导入效应细胞第39页/共49页细胞因子基因导入肿瘤细胞细胞因子基因导入肿瘤细胞是通过细胞因子受体基因转染的方法,使肿瘤细胞表面相应的细胞因子受体表达增多,使对肿瘤细胞有直接生长抑制或杀伤作用的细胞因子表达增多,从而大大增强细胞因子的抗肿瘤效果。第40页/共49页共刺激分子导入肿瘤细胞细胞的激活需要双信号,一类是特异的抗原提呈信号,另一类是非特异性的,非主要组织相容复合物(MHC)限制的共刺激信号,包括B淋巴细胞激活抗原分子(B7)、细胞间黏附分子(ICAMs)、淋巴细胞功能相关抗原3(LFA23)、血管内皮黏附分子(VCAM21)、热稳定抗原(HAS)等,在这些共刺激分子中,最重要的、研究最多的是B7分子。Schen2del等将B7-1共刺激分子基因导入人癌细胞株制备成瘤苗,这些经过共刺激分子基因修饰的肿瘤细胞不仅能诱导CTL增殖,并能有效地引起肿瘤细胞的溶解。第41页/共49页主要