普通微生物外源基因在细菌中的表达

普通微生物外源基因在细菌中的表达第一页，共四十八页，2022年，8月28日大肠杆菌毕赤酵母番茄叶子Hela细胞第二页，共四十八页，2022年，8月28日大肠杆菌中表达外源基因1.同源克隆获得对虾整合素的cDNA全长序列第三页，共四十八页，2022年，8月28日大肠杆菌中表达外源基因2.整合素多序列比对和空间结构分析金属离子结合位点第四页，共四十八页，2022年，8月28日大肠杆菌中表达外源基因3.整合素的βA结构域的重组与蛋白纯化M12M3456TrxβAM:蛋白marker1：pET32-integrin重组蛋白诱导前2：pET32-integrin重组蛋白诱导后3：纯化的pET32-integrin重组蛋白4：pET32诱导前5：pET32诱导后6；纯化的Trx蛋白第五页，共四十八页，2022年，8月28日大肠杆菌中表达外源基因4.整合素在大肠杆菌中大量培养及纯化第六页，共四十八页，2022年，8月28日大肠杆菌中表达外源基因5.整合素重组蛋白的活性鉴定第七页，共四十八页，2022年，8月28日表达载体表达载体：具有宿主细胞基因表达所需调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。第八页，共四十八页，2022年，8月28日克隆载体与表达载体的区别克隆载体：高拷贝、导入原核细菌、大量复制。表达载体：高拷贝或低拷贝、导入工程菌或细胞（导入的基因由克隆载体产生、高蛋白表达效率。克隆载体是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。表达载体第九页，共四十八页，2022年，8月28日一、外源基因的转录1、启动子

位于转录起点上游，为RNA聚合酶结合并起始转录的一段DNA控制序列。-35区：RNA聚合酶识别并结合的位点-10区：RNA聚合酶于该处解开DNA双链，并决定转录起点第十页，共四十八页，2022年，8月28日启动子的种类（1）Lac启动子:乳糖操纵子启动子

Lac启动子受CAP（分解物激活蛋白）和cAMP的正调控第十一页，共四十八页，2022年，8月28日启动子的种类（1）Lac启动子:(IPTG)

Lac启动子受阻遏蛋白的负调控，lacUV5失去了CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)时就可启动转录。第十二页，共四十八页，2022年，8月28日启动子的种类（2）Trp启动子:Trp启动子的阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性，因此，缺乏色氨酸时，该启动子启动，色氨酸丰富时，则停止转录。色氨酸操纵子第十三页，共四十八页，2022年，8月28日启动子的种类（3）Tac启动子:Tac启动子是一组由Lac和Trp人工构建启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和Trp

都强。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac第十四页，共四十八页，2022年，8月28日启动子的种类（4）PL、R启动子:cI基因编码λ噬菌体基因组cI基因的温度敏感突变株cI857ts温度30℃42℃产生阻遏蛋白阻遏启动子转录cI857ts蛋白失活启动子转录第十五页，共四十八页，2022年，8月28日启动子的种类（5）T7噬菌体启动子:通过加入诱导物或升温，启动T7RNA聚合酶基因转录，合成T7RNA聚合酶，识别T7启动子，从而启动外源基因高效表达。第十六页，共四十八页，2022年，8月28日一、外源基因的转录2、转录的调节与控制主要的转录调控方式：（1）诱导物诱导（2）温度诱导（3）RNA聚合酶调节第十七页，共四十八页，2022年，8月28日一、外源基因的转录3、转录终止子

一段位于基因或操纵子的3′端，具有终止转录功能的特定DNA序列。-RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放下来。第十八页，共四十八页，2022年，8月28日二、外源基因的翻译1、核糖体结合位点√1974年Shine和Dalgarno首先发现，简称SD序列；√mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列；√位于mRNA起始密码子AUG上游3~10bp左右，富含嘌呤序列。真核生物的mRNA上没有SD序列，原核细胞表达真核基因时，要置于SD序列后。第十九页，共四十八页，2022年，8月28日二、外源基因的翻译2、密码子的偏爱性密码子高频出现的密码子称为偏爱密码子，对应于丰富的tRNA密码子，低频出现的密码子为稀有密码子。第二十页，共四十八页，2022年，8月28日二、外源基因的翻译3、终止密码子蛋白质翻译过程中终止肽链合成的信使核糖核酸（mRNA）的三联体碱基序列。一般情况下为UAA、UAG和UGA，它们不编码氨基酸。第二十一页，共四十八页，2022年，8月28日比较启动子和起始密码子、终止子和终止密码子截然不同的概念。启动子和终止子都是一段特殊的DNA序列，属于基因的非编码区，分别位于编码区的上游和下游，负责调控基因的转录；起始密码子和终止密码子都是mRNA上的三联体碱基序列，分别决定翻译的起始和终止。第二十二页，共四十八页，2022年，8月28日表达载体的要求与主要调控元件利用原核细胞表达真核基因时应注意：基因的编码区必须是连续的；基因必须置于原核细胞启动子、SD序列和终止子之下；产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白折叠防止蛋白酶的降解。第二十三页，共四十八页，2022年，8月28日三、外源基因的表达产物1、非融合蛋白表达外源蛋白不与宿主蛋白融合，使其自身单独表达。非融合蛋白表达载体AUG第二十四页，共四十八页，2022年，8月28日三、外源基因的表达产物防止非融合蛋白降解的措施√采用蛋白酶含量很低的突变株作为宿主菌√利用胞内蛋白酶抑制剂√分泌、包涵体第二十五页，共四十八页，2022年，8月28日三、外源基因的表达产物2、融合蛋白表达融合蛋白表达载体麦芽糖结合蛋白

蛋白酶裂解位点

外源蛋白凝血因子Xa外源蛋白第二十六页，共四十八页，2022年，8月28日三、外源基因的表达产物融合蛋白表达的优点√较易获得高效表达；√在细胞内比较稳定；√许多融合蛋白可用作抗原。融合蛋白中目标蛋白的分离纯化√酶法：加入蛋白酶切位点Ile-Glu-Gly-Arg可被凝血因子Ⅹa识别并在C端切开；√化学法：外源蛋白与细菌蛋白之间加入Met，用CNBr裂解。第二十七页，共四十八页，2022年，8月28日3、外源基因的分泌产物分泌表达信号肽√释放有活性的蛋白；√免受宿主细胞中蛋白酶降解。第二十八页，共四十八页，2022年，8月28日3、外源基因的分泌产物包涵体√难溶、非正确折叠、无生物活性；√可获得大量的外源蛋白。第二十九页，共四十八页，2022年，8月28日第三十页，共四十八页，2022年，8月28日一、基因工程药物胰岛素全球糖尿病发病人数共3.82亿，中国占到全球的四分之一，共9800万。胰岛素参与调节碳水化合物和脂肪代谢，控制血糖平衡，因此胰岛素可用于治疗糖尿病。第三十一页，共四十八页，2022年，8月28日重组人胰岛素方法一：AB链合成——已被淘汰以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融合基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。方法二：逆转录法第三十二页，共四十八页，2022年，8月28日重组人胰岛素方法一：AB链合成第三十三页，共四十八页，2022年，8月28日重组人胰岛素方法二：逆转录法第三十四页，共四十八页，2022年，8月28日乙肝疫苗接种人群广泛乙肝病毒表面抗原基因酵母细胞蛋白纯化乙型肝炎疫苗第三十五页，共四十八页，2022年，8月28日疫苗？第三十六页，共四十八页，2022年，8月28日二、基因工程在农业上的应用转基因大豆2006年，转基因大豆依然是最主要的转基因作物，占全球转基因作物总种植面积的57%。转基因大豆主要有两种，即抗除草剂转基因大豆和抗虫转基因大豆。美国的转基因大豆出油率高、价格比中国东北大豆更便宜，中国中粮集团等公司都大量进口美国大豆。第三十七页，共四十八页，2022年，8月28日二、基因工程在农业上的应用大豆产品第三十八页，共四十八页，2022年，8月28日你对转基因食品什么态度？第三十九页，共四十八页，2022年，8月28日二、基因工程在农业上的应用转基因动物第四十页，共四十八页，2022年，8月28日转基因猪用途及展望2、增加抗病性通过转基因来增强猪对疾病的抵抗力也是一项很有前途的研究领域，但是，这方面的研究仍较少。

1、提高生产性能

获得的转基因猪生长速度提高11.8%～14.2%，也留下了一些后遗症，死胎和畸形率较高，患关节病、胃溃疡、肾病和生殖能力丧失症的较为普遍。

3、作为人类疾病的研究模型建立了包括皮肤、消化器管和心血管系统等相关疾病的转基因猪模型。.。

第四十一页，共四十八页，2022年，8月28日转基因猪用途及展望4、用作生物反应器人们可以将编码罕见的，具有医用价值的人体蛋白基因转移给猪，使其在猪体的血液或乳腺等组织中表达，从而可以在乳汁或血液中获取转基因表达产物。

5、异种器官移植

第四十二页，共四十八页，2022年，8月28日三、基因治疗

指向靶细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗的目的。1.用正常的基因弥补有缺陷的基因—遗传病；2.通过移植基因刺激免疫力—肿瘤和艾滋病；3.基因转移配合细胞或药物治疗—增强特异性或疗效。第四十三页，共四十八页，2022年，8