核酸化学理化性质

核酸化学理化性质第一页，共四十五页，2022年，8月28日第一节.核酸概述第二节.核酸的结构第三节.核酸的物理化学性质第四节.核酸的研究方法第二页，共四十五页，2022年，8月28日核酸的理化性质第三节目录P503第三页，共四十五页，2022年，8月28日一、核酸的一般性质(了解)①核酸和核苷酸既有磷酸基，又有碱性基团，所以是两性电解质，由于磷酸酸性较强常表现酸性。②晶形-DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末。③粘度—大多数DNA为线性分子，分子极不对称，长度可达几厘米，而直径只有几纳米，所以即使是极稀的DNA溶液，也有极大的粘度，RNA溶液的粘度要小得多。④溶解性：微溶于水(溶液呈酸性)，不溶于一般有机溶剂，在70%乙醇中形成沉淀==>用70-95%乙醇提纯核酸。核苷酸无色、溶于水。

RNA易溶于低盐(0.14MNaCl)，DNA易溶于高盐浓度(1MNaCl)。室温下，稀碱能水解RNA，而DNA稳定。稀酸可水解DNA，而浓酸可水解RNA。⑤旋光性-均很强第四页，共四十五页，2022年，8月28日二、核酸的水解(P503,掌握)核酸碱基与戊糖形成的N-糖苷键。磷酸基与两种糖分别形成核糖磷酸酯和脱氧核糖磷酸酯。这些糖苷键和磷酸酯键都能被酸或碱和酶水解。第五页，共四十五页，2022年，8月28日糖苷键和磷酸酯键都能发生酸水解，但糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解。嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定。对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。DNA在pH1.6于37℃对水透析即可完全除去嘌呤碱。在pH2.8于100℃加热1h，也可完全除去嘌呤碱。水解嘧啶碱需要较高的温度。用甲酸（98％-100％）密封加热至175℃2h，无论RNA还是DNA都可以完全水解，产生嘌呤和嘧啶碱，缺点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155℃加热60min（水解DNA）或80min（水解RNA），嘧啶碱的回收率显著提高。

1．酸水解第六页，共四十五页，2022年，8月28日RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸；用于水解RNA的碱有NaOH和KOH，以KON较好，碱浓度一般为0.3-1mol/L，在室温至37℃下水解18～24h即可水解完全。DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。DNA一般对碱稳定，在1mol/LNaOH中加热至100℃4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。

2．碱水解第七页，共四十五页，2022年，8月28日总结．酸或碱的水解核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别？与RNA核糖基上2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。第八页，共四十五页，2022年，8月28日

水解核酸的酶类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶称为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。3.酶水解第九页，共四十五页，2022年，8月28日①按底物专一性分类两类：以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。②根据作用方式分两类：核酸外切酶和核酸内切酶。作用位点在多核苷酸链内部的为核酸内切酶。从多核苷酸链的末端开始，逐个的将核苷酸切下，从而使核酸进行降解的酶称为外切酶。③按磷酸二酯键断裂的方式分两类：一种是在3’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5’-核苷酸或寡聚核苷酸。另一种是在5’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3’-核苷酸或寡聚核苷酸。④其它分类标准还有对底物二级结构的专一性，作用于双链核酸的叫双链酶，作用于单链的叫单链酶。核酸外切酶作用的方向性，3’→5’或5’→3’。对磷酸二酯键两侧的碱基有无选择性等。（1）核酸酶的分类第十页，共四十五页，2022年，8月28日①牛胰核糖核酸酶（RNaseI）

只作用于RNA，不作用于DNA。且具有极高专一性的酶，其作用位点是嘧啶核苷-3’-磷酸与其他核苷酸之间的键（5’-磷酸酯键）。产生3’-嘧啶核苷酸或以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。(P503)②核糖核酸酶T1

具有比RnaseI更高的专一性。他作用的位点是3’-鸟苷酸与其相邻核苷酸的5’-OH之间的连键。产生3’-鸟苷酸或以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸。③核糖核酸酶T2

主要作用点为Ap残基，可以将tRNA完全降解成3’-腺苷酸结尾的寡核苷酸。（2）核糖核酸酶类（RNase）第十一页，共四十五页，2022年，8月28日①牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseI）切断双链DNA或单链DNA成为以5’-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度为4核苷酸。②牛脾脱氧核糖核酸酶（DnaseII）降解DNA成为3’-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度为6核苷酸。③链球菌脱氧核糖核酸酶核酸内切酶，作用于DNA，产物为5’-磷酸为末端长度不同的碎片。④限制性内切酶在细菌中发现，主要降解外源DNA。具有严格的碱基序列专一性。它能专一识别并切割DNA上特定碱基序列，产物仍为双链DNA片段。限制内切酶的识别和切割位点通常是4-6bp组成的回文结构。切开后的产物具有粘性末端。限制性内切酶在基因工程中得到广泛应用。（4）N-糖苷酶—水解糖苷键。（3）脱氧核糖核酸酶（DNase）第十二页，共四十五页，2022年，8月28日注：生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。第十三页，共四十五页，2022年，8月28日核酸的两性性质及等电点与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4～4.5；RNA的等电点为2～2.5。RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。三、核酸的酸碱性质(P504,了解)第十四页，共四十五页，2022年，8月28日碱基的碱性

嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱性。环内氨基的pKa值约为9.5。碱基环外的氨基（存在于A、G和C）的碱性很弱，在生理pH条件下不能被质子化。这种情况与苯胺分子中的氨基相似。因此嘌呤和嘧啶碱基的碱性主要是环内氨基的贡献。第十五页，共四十五页，2022年，8月28日四.核酸的紫外吸收(P507，了解)在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，使DNA和RNA在240～290nm处有强烈紫外吸收，最大吸收峰在260nm左右，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光第十六页，共四十五页，2022年，8月28日第十七页，共四十五页，2022年，8月28日1.用A260/A280判断核酸样品的纯度：由于核酸的紫外吸收最大吸收值在260nm处。蛋白质最大吸收值在280nm处。利用这一特性，可以鉴别核酸样品中的蛋白质杂质，还可以对核酸进行定量测定。用OD260/OD280比值来判断样品纯度。一般纯DNA比值≥1.8，纯RNA比值应达到2.0，若含杂蛋白及苯酚，比值会明显下降。2.对于纯的DNA或RNA样品，可用该法作定量测定

50μg/ml双链DNA通常当A260=1.0相当于：40μg/ml单链DNA（或RNA）

20μg/ml寡核苷酸优点：快速、准确、所需样品量少OD260的应用目录第十八页，共四十五页，2022年，8月28日五．核酸的变性、复性与杂交问：核酸变性与核酸降解的区别？核酸的变性只涉及双螺旋区的氢键断裂，并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。问：核酸变性后物化性质也会发生哪些变化呢？答案：粘度下降；紫外吸收值A急剧增加；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性丧失等。(1)核酸的变性(P508,掌握)1.定义：指高温、酸碱以及某些变性剂能破坏核酸中的氢键，使有规律的双螺旋型结构变成单链的、无规律的“线团”，这种作用就称为核酸的变性。第十九页，共四十五页，2022年，8月28日DNA变性的本质是双链间氢键的断裂第二十页，共四十五页，2022年，8月28日2.引起核酸变性的因素：很多由温度升高引起的变性称为热变性；由酸碱度改变引起的变性称酸碱变性；变性试剂如尿素、甲醛、胍类、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等均可引起核酸的变性。第二十一页，共四十五页，2022年，8月28日DNA的熔点其中DNA的热变性一般在较窄的温度范围内发生，很像固体结晶物质在其熔点突然熔化的情况。因此通常把加热变性使DNA双螺旋结构失去一半时的温度称为熔点或溶解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在82-95C之间。第二十二页，共四十五页，2022年，8月28日DNA变性是个突变过程，类似结晶的熔解。的温度称熔解温度。通常将紫外吸收的增加量达到最大增量一半（即加热变性使DNA双螺旋结构失去一半）时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度(meltingtemperature,Tm)。TmTm第二十三页，共四十五页，2022年，8月28日热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。目录第二十四页，共四十五页，2022年，8月28日第二十五页，共四十五页，2022年，8月28日Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。其大小与G+C含量成正比。目录第二十六页，共四十五页，2022年，8月28日①DNA的均一性均一性越高，DNA的解链温度越窄。均质DNA熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。Tm值可作为衡量DNA样品均一性的标准。②G-C的相对含量越多，Tm值越高。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式推算Tm值或G-C含量：（G+C)%=（Tm-69.3）×2.44问：DNA的Tm值与哪些因素有关呢？第二十七页，共四十五页，2022年，8月28日③介质中的离子强度离子强度较低，DNA溶解温度较低，且溶解温度范围较宽。离子强度较高，DNA溶解温度较高，且溶解温度范围较窄。故DNA不应保存在极烯的溶液中。④pH值的影响高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。⑤变性剂的影响如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。第二十八页，共四十五页，2022年，8月28日由于RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。具体：变性曲线不那么陡，Tm值也较低。利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。例如，天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%.而RNA变性后，约增加1.1%。这种现象称为增色效应.3.RNA的变性第二十九页，共四十五页，2022年，8月28日变性后的核酸在260nm处的紫外吸收明显升高，称增色效应。核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。这是检测核酸变性的一个最简便的方法。思考：增色效应的原因？当核苷酸摩尔数相同时，A260值大小如下关系：单核苷酸>单链DNA>双链DNA4.增色效应的原因(P508)第三十页，共四十五页，2022年，8月28日DNA复性的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。减色效应：

DNA复性时，其溶液OD260降低。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。退火温度＝Tm－25℃目录(2)核酸的复性(P508,掌握)第三十一页，共四十五页，2022年，8月28日DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。复性影响因素：分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。第三十二页，共四十五页，2022年，8月28日影响复性速度的因素：（1）溶液温度的高低（Tm–25℃）（2）单链片段的大小（3）单链片段浓度（4）片段内重复序列的多少（5）溶液离子强度的大小第三十三页，共四十五页，2022年，8月28日附：DNA的复性一般只适用于均一的病毒和细菌的DNA，至于哺乳动物细胞中的非均一DNA，很难恢复到原来的结构状态。这是因为各片断之间只要有一定数量的碱基彼此互补，就可以重新组合成双螺旋结构，碱基不互补的区域则形成突环。复性速度的因素影响：顺序简单的DNA分子比复杂的分子复性要快；DNA浓度越高，越易复性；此外，DNA片断大小、溶液的离子强度等对复性速度都有影响。复性后DNA的表现：物理化学性质能得到恢复，如紫外光吸收值下降，粘度增高，比旋增加，生物活性也得到部分恢复。第三十四页，共四十五页，2022年，8月28日DNA复性第三十五页，共四十五页，2022年，8月28日A.概念:在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交1.核酸分子杂交的概念和原理(了解)(3)核酸的分子杂交(hybridization)

简单来说：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。可形成DNA—DNA双链分子；DNA—RNA双链分子；RNA—RNA双链分子。第三十六页，共四十五页，2022年，8月28日B.原理:是只要两种单链分子之间存在着一定程度的同源性，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以按照碱基互补配对原则，在不同的分子间退火形成杂化双链。第三十七页，共四十五页，2022年，8月28日第三十八页，共四十五页，2022年，8月28日DN