TSPOT诊断结核感染

TSPOT诊断结核感染第1页/共49页主要内容结核病及其诊断现状T-SPOT.TB的原理及其特点T-SPOT.TB技术的应用2第2页/共49页主要内容结核病及其诊断现状T-SPOT.TB的原理及其特点T-SPOT.TB技术的应用3第3页/共49页结核的现状

结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO统计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上。4第4页/共49页中国是结核感染高负担国家患者人数占全球的14.3%，具体表现为“五多”感染人数多—5.5亿人感染过结核患病人数多—现有活动性肺结核患者500万潜伏感染人数多—受限于检测条件较难统计，2009年流行病调查结果为总人口的44.5%（因采用PPD检测，假阳性较多）新发患者多—仅活动性肺结核2009年新发病患107万死亡人数多—13万/年5第5页/共49页结核的传统诊断手段结核菌素皮试：低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。低特异性：与卡介苗接种和其他环境分枝杆菌有交叉，易造成“假阳性”结果。免疫学诊断─抗原、抗体（胶体金）细菌学检查：常规培养：2月；快速培养：1周；涂片阳性率取决于采集标本中细菌数量，不利于早期诊断。病理学检查：阳性率低，对取材有较高要求，有创伤，对肉芽肿性病变需进一步鉴别。分子生物学诊断─PCR影像学检查6第6页/共49页

免疫学诊断PPD皮肤试验抗体检测假阳性率高48-72h读取结果敏感性、特异性差7第7页/共49页WHO关于血清学检测声明2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）正式声明，要求禁止将血清学检测方法（抗原，抗体，蛋白芯片等）用于肺结核和肺外结核的诊断。WHOwarnsagainsttheuseofinaccuratecommercialserologicaltestsforpulmonaryandextra-pulmonaryTB.AsubstandardtestwithunreliableresultsTBcanbewronglydiagnosedAserologicaltestfordiagnosingactiveTBdiseaseisbadpracticeProblemsofmisdiagnosisTheinaccurateserologicaltestsarecostlySellingsubstandardtestswithunreliableresults8第8页/共49页细菌学诊断抗酸染色涂片分枝杆菌培养阳性率低含菌量≥1万/mL痰液需时4-6周9第9页/共49页快速培养系统1.BDBACTECMGIT960培养系统2.BacTALERT3D培养系统10第10页/共49页分子生物学诊断•实时荧光定量PCR技术：HRM•线性探针耐多药检测技术：HAIN技术•基因芯片•PCR–电离质谱检测技术11第11页/共49页病理学检查阳性率低对取材有较高要求，有创伤对肉芽肿性病变需进一步鉴别12第12页/共49页

影像学检查目前诊断活动性肺结核的重要手段，尤其是粟粒性肺结核对潜伏性结核诊断价值不大对肺外结核诊断价值不大13第13页/共49页现有检测手段不能满足临床要求假阴性：免疫力低下或HIV人群，新生儿、老弱人群，药物影响；假阳性：BCG接种人群，其它分支杆菌感染，交叉污染肺外的结核感染无法明确诊断抗痨治疗疗效无法评价无法排筛结核感染，造成生物制剂或移植手术治疗后病患免疫力下降，引发结核，形成医疗事故14第14页/共49页主要内容结核病及其诊断现状T-SPOT.TB的原理及其特点T-SPOT.TB技术的应用15第15页/共49页21世纪结核检测的重大突破

γ-干扰素释放实验（IGRAs)被商化（2006年），用于结核感染的检测将结核菌特异性抗原加入含受试者的血液标本的培养基中进行孵化，如果受试者受到过MTB感染，那么被结核菌激活的记忆T细胞就会对这些特异性抗原产生反应，发生增殖分化并释放γ-干扰素通过定量检测γ-干扰素的释放水平，来诊断MTB感染T-SPOT.TB(结核感染T细胞斑点试验)16第16页/共49页γ干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞γ干扰素17第17页/共49页基于T淋巴细胞检测结核感染的原理结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆性T细胞当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放r干扰素r干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要的细胞因子18第18页/共49页基于T淋巴细胞检测结核感染的原理T-SPOT.TB技术：利用结核杆菌感染者外周血单核细胞（PBMC）中存在结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异抗原刺激后分泌r干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。检测外周血中受结核特异抗原刺激释放r干扰素的T淋巴细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表一个细胞，计算出抗原特异性细胞的频率。19第19页/共49页基于T淋巴细胞检测结核感染的原理包20第20页/共49页基于T淋巴细胞检测结核感染的原理患者体内存在针对MTB的效应T淋巴细胞患者体内不含针对MTB的效应T淋巴细胞21第21页/共49页T-SPOT.TB的临床意义T-SPOT.TB高灵敏度

22第22页/共49页T-SPOT.TB的临床意义种类内容摘要受试者数量文献发表活动性结核/灵敏度将T-SPOT.TB的检测结果与最后通过涂片和培养确诊的结果进行比较。包括牛型结核杆菌和非洲型结核杆菌感染的患者。T-SPOT.TB的灵敏度为97.2%。（CI90.3-99.7%）72MeieretalEurJMicrobiolInfectDis(2005)；24:529-536在经培养确诊的活动性结核受试者中，T-SPOT.TB的灵敏度为96.6%。其中29例免疫力低下患者，T-SPOT.TB的灵敏度为100%87Leeetal.ERJ2006;28:24–30在确诊病例（涂片或培养阳性）和临床诊断病例（有临床症状和抗痨治疗有效）中，T-SPOT.TB的灵敏度为90.3%，并且不受CD4细胞数量影响。30Clarketal.Clin.Exp.Imm.2007;150(2):238-44在经痰培养或肺部病变组织病理活检确诊的结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度为92%。140KangetalChest.2007Sep;132(3):959-65在确诊的肺结核患者和疑似肺外结核患者中，T-SPOT.TB的阳性率94%。32Kimetal.ArchInternMed.2007;167;20:2255-2259在免疫力正常和免疫力低下的受试人群中，T-SPOT.TB的灵敏度分别为94%和95%。所有受试者中，42%为肺外结核患者。186Kimetal.AmJMed2009；122,189-195经培养确诊、抗痨治疗不超过2周的结核患者用T-SPOT.TB检测，阳性率98%（57/58）。58JanssensetalERJ2007；30(4):722-8在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度为94%。32DominguezetalClinVaccImmunol2008;15;168-71在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度为94.1%。270CheeetalJClinMicrobiol.2008;46(6):1935-4023第23页/共49页T-SPOT.TB的临床意义T-SPOT.TB高特异性

ESAT-6＆CFP10均来自结核分枝杆菌基因组RD1区域仅结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）存在

RD1区基因卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因（M.gordonae、M.kansasii、M.marinum、M.szulgai）

T-SPOT.TB不会受卡介苗接种及其他分枝杆菌的影响

24第24页/共49页T-SPOT.TB的临床意义种类内容摘要受试者数量文献发表特异性用T-SPOT.TB检测14例鸟分枝杆菌感染者，13例阴性，1例为临界值，复查也为阴性。14AdamsetalSc.JInf.Dis..2008;40(3):196-203.经过结核筛查的无症状的受试者，T-SPOT.TB检测结果全部为阴性，特异性100%。47Clarketal.Clin.Exp.Imm.2007;150(2):238-44在德国用T-SPOT.TB对健康的卫生保健工作者进行筛查。仅1例阳性（1/95）

，为影像学工作者，接触病人超过35年。

TST检测假阳性结果34%（32/95）。

95Barsegianetal.JofHospitalInf2008；69(1):69-76在接触结核的健康医务工作者和健康对照受试者中用TST和T-SPOT.TB检测。155健康医务工作者中，TST阳性的27例，而T-SPOT.TB仅3例阳性。健康对照组T-SPOT.TB全部阴性而TST有3例阳性。

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Storlaetal.BMCInfectiousDiseases2009,9:60

25第25页/共49页T-SPOT.TB的高特异性与灵敏度，给临床准确、快速的诊断结果特异性美国FDA临床研究数据：特异性97.1%(297/306)国内临床研究数据：特异性94.1%(478/508)灵敏度美国FDA临床研究数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床研究数据：灵敏度95.3%(624/655)26第26页/共49页T-SPOT.TB的临床意义基于结核抗原特异性T细胞向病变部位集中的特点，T-SPOT.TB的检测物已不局限于静脉血，支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等也可用于对肺内及肺外结核的诊断。敏感性优于ADA、TB-DNA，约在62-75%，特异性无统计学差异。27第27页/共49页T-SPOT.TB的临床意义在结核病治疗中的评价意义效应T细胞随结核杆菌的清除而消失，其阴性及阳性结果可作为评估治疗效果的手段之一。28第28页/共49页T-SPOT.TB的缺点仍有一定的假阳性及假阴性结果实验结果是对结核感染的判断，阳性结果包括了活动性结核及潜伏性结核感染的可能，需要结合临床来确诊是否是结核病患者不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床来判断29第29页/共49页主要内容结核病及其诊断现状T-SPOT.TB的原理及其特点T-SPOT.TB技术的应用30第30页/共49页病例1•患者，男，35岁•患者于一月前开始无诱因下出现高热、胸闷，动则气急，无咳嗽，咯血，盗汗。•胸片：两肺（－），右侧胸腔积液，心包积液•心超：心包积液•心包穿刺：血性•诊断：肿瘤？结核？细菌感染？……31第31页/共49页检测结果•外周血T-SPOT.TB：阳性•心包积液T-SPOT.TB：阳性•诊断：结核性心包炎•治疗：INH、RFP、PZA、EMB、强的松•体会：诊断快速–心包积液结核培养6周后报阳32第32页/共49页病例2•患者，女性，60岁，浙江温州人•主诉：反复发热2月余，头痛2周伴意识障碍2天•外院头颅MRI见脑实质内弥漫性点状、结节状及环形病灶。•有皮肌炎史，外院予激素治疗33第33页/共49页腰穿•压力250mmH2O，有核细胞420x106/L，糖0.6mmol/L，蛋白1688mg/L，氯化物136mmol/L•隐球菌乳胶凝集试验：阴性34第34页/共49页治疗：抗细菌+抗结核•美罗培南、利奈唑胺、异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇治疗，同时予甘露醇250mlq8h及地塞米松每天7.5mg。•2天后患者体温即平，意识障碍好转•脑脊液T-SPOT.TB：阳性•诊断：倾向结核性脑膜脑炎35第35页/共49页五联抗结核•给予HRZE及左氧五联抗结核•2周后，CSF分枝杆菌快速培养：阳性•3个月后：36第36页/共49页病例3•女性，14岁，初中学生•主诉：发热1月余•患者5月初无明显诱因下出现发热，Tmax：39℃，以午后为著。伴头晕、畏寒、盗汗，不伴寒战、咳嗽、咳痰、四肢肌肉痛、皮疹等，家人自行予退烧药（具体药物不详），体温可恢复正常，但午后体温仍反复•2013-05-24患者就诊，查血常规示：WBC:4.7x109/L，N:43.2%。查尿常规示：WBC:8-10个/HP，Pro(++)。考虑为尿路感染，予头孢丙烯等抗感染治疗，但仍出现反复发热，病程中，患者无尿频、尿急、尿痛、腹胀、腹痛、腰痛等不适•2013-06-01予希刻劳0.5g及罗氏芬2.5g对症治疗后体温有所好转，但停药后体温仍上升•2013-06-09查肺CT示：左肺上叶炎性病变。增强CT示：左肺上叶炎性病变，左肺门及纵膈淋巴结肿大。B超示：左侧锁骨上、双侧腋窝（右腋下明显）淋巴结肿大37第37页/共49页结核病的实验室诊断停留在上世纪50年代水平38第38页/共49页入院后实验室检查•血常规：WBC:3.83x109/L,N:50.4%,L:39.4%,M:9.9%,Hb:118g/L,PLT:231x109/L•ESR：71mm/h。CRP：正常•尿常规（-）•自身抗体（-）•肿瘤标记物（-）•T-SPOT.TB（+）39第39页/共49页上腹部增强CT40第40