干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响

.../干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响摘要：以小麦幼苗为试验材料,研究干旱胁迫对小麦生理生化指标脯氨酸<Pro>、丙二醛<MDA>、过氧化氢<H2O2>、抗氧化酶〔PPO、POD、谷胱甘肽<GSH>、抗坏血酸〔ASA的含量的影响。试验结果表明：在干旱胁迫下除发芽率下降外,小麦幼苗的脯氨酸<Pro>、丙二醛<MDA>、过氧化氢<H2O2>、抗氧化酶〔PPO、POD、谷胱甘肽<GSH>的含量都比正常情况下小麦幼苗的含量多。关键词：干旱胁迫小麦幼苗生理生化指标引言：植物体生存在自然环境中,其水热条件随时都变化,对植物多少会产生一些影响。凡是对植物产生伤害的环境都被称为逆境,也称胁迫。干旱也属于逆境,水分在植物的生命活动中占主导地位。大多数植物遭受干旱逆境后各个生理过程都会受到不同程度的影响。如生理生化指标脯氨酸<Pro>、丙二醛<MDA>、过氧化氢<H2O2>、抗氧化酶〔PPO、POD、谷胱甘肽<GSH>等发生变化。小麦的生长不仅受到自身遗传物质的控制,还受到众多环境因子的影响,如光、温、水和土壤营养物质等。世界上约有70%的小麦播种面积分布在干旱、半干旱农业区,干旱对小麦的生理、生化都产生重要的影响,进而影响小麦的生长发育、产量和品质。因此,为了减小环境对小麦生产的影响,有必要从小麦的各项生理生化指标含量的变化,来研究干旱胁迫对小麦的影响。本次实验是研究吸胀12小时萌发一周后,干旱处理一周的小麦其生理生化指标脯氨酸<Pro>、丙二醛<MDA>、过氧化氢<H2O2>、抗氧化酶〔PPO、POD、谷胱甘肽<GSH>、抗坏血酸〔ASA含量的变化。一、材料与方法1、材料及处理将吸胀12小时的小麦种子在有6层湿润滤纸的带盖白磁盘〔24cmX16cm培养基中生长7天,7天后将其中一部分幼苗干旱生长7天,7天后用相同的方法分别对实验组和对照组的小麦进行脯氨酸<Pro>、丙二醛<MDA>、过氧化氢<H2O2>、抗氧化酶〔PPO、POD、谷胱甘肽<GSH>、抗坏血酸〔ASA的含量的测定。2、测定方法[1]<1>小麦种子发芽率的测定各取50粒吸胀的小麦种子→沿胚的中心线切成两半〔严格区分两个半粒,进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色〔30℃水浴20min,另50个半粒进行曙红染色〔室温染色10min根据两种方法的染色情况,分别计算发芽率。<2>脯氨酸<Pro>含量的测定①脯氨酸<Pro>的提取：分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL3%磺基水杨酸〔SSA和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。②脯氨酸<Pro>的测定：上清液各2mL→分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min〔若没沉淀可略此步骤→分别测定A520,将测得的结果用公式Procontent=计算出正常和干旱生长小麦的胚芽鞘的脯氨酸含量。<3>丙二醛<MDA>含量的测定①丙二醛<MDA>的提取：分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL10%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2mL10%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。②丙二醛<MDA>的测定：分别取上清液各2mL→加入0.6%TBA〔用10%TCA配制2mL→煮沸12min→冷却后→5000rpm离心5min→分别测定OD450和OD532将测得的OD450和OD532的数据带入下列公式OD450=C1x85.4OD532=C1x7.4+C2X155000C1：可溶性糖的浓度,C2：MDA的浓度解方程计算出C1可溶性糖的浓度,C2MDA的浓度。<4>过氧化氢<H2O2>含量的测定①过氧化氢<H2O2>的提取：分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL50mMPBS<pH=6.8,内含1mMHA>和少许石英砂→充分研磨→用2mLPBS洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。②过氧化氢<H2O2>含量的测定：分别取上清液各3mL→加入0.1%Ti<SO4>2[用20%<v/v>H2SO4配制]1mL→摇匀→5000rpm离心10min→OD410将测得的OD410值带入下列公式H2O2content=〔mmol.g-1FW计算出H2O2酶的含量。<5>抗氧化酶〔PPO、POD的测定①抗氧化酶〔PPO、POD的提取：分别取0.1g实验材料→加入少许石英砂和3ml提取液〔50mmol/LPBS,pH6.0,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP→充分研磨→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5ml→用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。②POD测定：取POD反应混合液〔10mmol/L愈创木酚,5mmol/LH2O2,用PBS溶解2.95ml,加入酶液50ul〔空白调零用PBS取代,立即记时,摇匀,读出反应2min时的A470。③PPO测定：取PPO反应混合液〔20mmol/L邻苯二酚,用PBS溶解2.9ml,加入酶液0.1ml〔空白调零用PBS取代,立即记时,摇匀,读出反应2min时的A410。将测得的A470和A410数据带入公式PODactivities=〔umol.g-1FWPPOactivies=<U.g-1FW>计算出PPO和POD的值<6>谷胱甘肽<GSH>含量的测定①谷胱甘肽<GSH>的提取：分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸〔TCA和少许石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。②谷胱甘肽<GSH>含量的测定：上清液各1mL→分别加入2mL0.1MPBS<pH=7.7>→1mL2mMDTNB→25℃5min→测定A412将测得的A412值带入公式GSHcontent=用总用总显VVVWLA412<7>、ASA含量的测定①ASA的提取：分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3ml5%三氯乙酸〔TCA和少许石英砂→充分研磨→用2ml5%三氯乙酸〔TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5ml②ASA的测定：上清液各0.8ml〔空白用5%TCA代替→分别加入0.8ml0.15MNaH2PO4〔pH=7.4和蒸馏水→摇匀→分别加入0.8ml5%TCA、44%磷酸和4%联吡啶→摇匀→加入3%FeCl30.8ml→37℃15min→测定A525将测得的A525值带入公式GSHcontent=用总用总显VVVWLA525二、实验结果1、小麦发芽率的结果两种方法测得的小麦发芽率不同,TTC法测得的小麦种子成活26粒,发芽率为52%,而署红法测得的小麦种子成活47粒,发芽率为94%。产生这种现象的原因是我们当时在做实验时不知道胚的具体位置,导致在切的时候没有沿胚切成两半,所以染色的结果刚开始是错误的。后面我们问了老师胚的位置,所以用署红法测得的结果基本接近实际。可能我们在数的时候有的因染色的部位少没有严格的区分导致结果没有达到100%。但是从结果可以看出,小麦的发芽率还是很高的。2、干旱胁迫对小麦胚芽鞘脯氨酸〔Pro含量的影响和分析实验测得：正常生长OD=0.006干旱生长OD=1.858从图中可以看出,小麦在干旱胁迫下时的脯氨酸的含量很高,为正常植株中的脯氨酸含量的262倍,这说明正常情况下小麦胚芽鞘内脯氨酸含量较低,但当遇到干旱胁迫时小麦胚芽鞘内的含量可以增加数十倍甚至几百倍。这一结果与XX农业科学洪法水李樊和在研究自然干旱胁迫下小麦品种游离脯氨酸与抗旱性的关系所得到的结果一致[2]。3、干旱胁迫对小麦胚芽鞘丙二醛〔MDA含量影响实验测得：正常生长OD450=0.045OD532=0.028干旱生长OD450=0.401OD532=0.291小麦MDA含量可溶性糖含量正常生长0.1554umol/L0.52695umol/L干旱生长1.65239umol/L4.69571umol/L由表格可以看出干旱胁迫下生长的小麦胚芽鞘内所含的可溶性糖和MDA量比正常生长的小麦所含量高。这一结果与XX农业大学研究生吴耀领再做抗旱性与丰产型小麦对干旱胁迫的响应所得到得结果一致[3]。4、干旱胁迫对小麦胚芽鞘过氧化氢〔H2O2含量影响。实验测得：正常生长OD410=0.098干旱生长OD410=0.414从图中可以看出干旱情况下的含量为98.57umol.g-1FW,正常情况下的为23.33umol.g-1FW,可以看出来干旱下的含量是正常生长的4倍多,这一结果与高方胜所作的土壤水分对番茄植物体内过氧化氢酶含量的含量变化相符,在干旱胁迫下植物体内的氧化酶含量升高相一致[4]。5、干旱胁迫对抗氧化酶〔PPO、POD含量的影响实验测得：POD正常生长A470=0.256干旱生长A470=0.972PPO正常生长A410=0.081干旱生长A410=0.151POD含量PPO含量干旱生长正常生长干旱生长正常生长0.93umol.g-1FWmin-10.24umol.g-1FWmin-1130.17umol.g-1FWmin-169.83umol.g-1FWmin-1结果表明,在干旱生长下的过氧化酶的含量比正常生长下要高很多,说明干旱胁迫下的POD和PPO活性比正常水平的POD和PPO活性强,从而在干旱生长时过氧化酶大量积累。6、干旱胁迫对谷胱甘肽〔GSH含量的影响和分析实验测得：正常生长OD412=0.096干旱生长OD412=0.183从图中可以看出,实验组GSH含量2.69umol.g-1FW,对照组含量1.41umol.g-1FW,实验组和对照组的含量存在差异,实验组GSH含量远比对照组的高。说明干旱胁迫使GSH含量升高。7、干旱胁迫对抗坏血酸〔ASA含量的影响和分析实验测得：正常生长OD525=0.007干旱生长OD525=0.021从图中可以看出,干旱生长下抗坏血酸〔ASA的含量比正常生长下抗坏血酸的含量高很多,说明小麦在正常情况下ASA的含量很低,但是当遇到干旱胁迫时,植株的ASA大量积累。三、结果分析与讨论本实验表明:在干旱胁迫下,小麦幼苗生长受到一定抑制作用,生理生化指标发生一系列变化,具体表现为：小麦幼苗胚芽鞘中脯氨酸<Pro>、丙二醛<MDA>、过氧化氢<H2O2>、抗氧化酶〔PPO、POD、谷胱甘肽<GSH>、抗坏血酸〔ASA的含量在干旱胁迫下含量较正常情况下的明显升高。1、干旱胁迫下脯氨酸〔Pro含量的变化：干旱胁迫下脯氨酸增加的原因为:①脯氨酸脱氢酶活性降低,使脯氨酸氧化减弱;②干旱抑制了蛋白质的合成,脯氨酸的利用降低,使其在植物体内积累增加。③脯氨酸的分解代谢开始于它的氧化分解,执行此功能的酶称为Pro脱氢酶<PDH>,它以FAD为辅因子将Pro降解为P5C,后者在P5C还原酶<P5CR>的作用下又重新合成谷氨酸,完成Pro代谢的循环过程。所以,在Pro的降解过程中PDH是Pro降解的关键酶。在逆境胁迫过程中,PDH的活性往往受到不同程度的限制,从而削弱了Pro的降解过程,因此越来越多的脯氨酸被积累。在正常情况下,脯氨酸含量总是很低。但一旦遇到干旱,脯氨酸的含量可增加数十倍甚至上百倍。脯氨酸含量的增高能够降低叶片细胞的渗透势,防止细胞脱水。脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程,是最有效的渗透调节物质之一,是由谷氨酸通过吡咯啉—5—羧酸形成的,存在于胞质溶胶中。脯氨酸作为渗透调节物质,用于保持胞质溶胶与环境的渗透平衡,防止水分散失。同时脯氨酸能够保持膜结构的完整性,脯氨酸具有很高的水溶性,可以保护细胞膜系统[5]。因此,脯氨酸的积累是植物适应持久干旱所必需的。2、干旱胁迫下丙二醛〔MDA含量的变化：植物在干旱胁迫下的质膜伤害与膜透性的增加是干旱伤害的本质之一。丙二醛是膜脂过氧化物作用的主要产物之一,是膜系统受伤害的重要标志,膜脂过氧化作用愈强,MDA含量愈高,膜被伤害程度愈重。MDA对细胞质膜和细胞中的许多生物功能分子均有很强的破坏作用。它能与膜上的蛋白质氨基酸残基或核酸反应生成shiff碱,降低膜的稳定性,加大膜透性,促进膜的渗漏,使细胞器膜的结构、功能紊乱,严重时导致细胞死亡。本实验证明了在干旱胁迫下丙二醛大量积累。梁新华等[6]在研究干旱对甘草幼苗根系的影响时发现甘草根系MDA的含量随干旱胁迫程度的增强而升高,受旱时甘草幼苗根系产生了膜脂过氧化作用。李明等[7]在研究干旱对甘草幼苗的影响时也发现随干旱胁迫时间的延长,甘草幼苗MDA含量呈增加趋势。3、干旱胁迫下过氧化氢〔H2O2含量的变化：过氧化氢酶大量分布于动植物细胞内,属于活性氧清除剂,对H2O2和羟自由基有清除能力,是一种细胞保护酶。水分胁迫等逆境条件使细胞活性氧代谢失调,超氧物阴离子自由基和H2O2等活性氧累积并超过膜伤害阈值,从而导致膜脂过氧化作用加剧。SOD引发细胞膜中不饱和脂肪酸发生膜脂过氧化作用,将导致膜脂的分解,破坏膜的结构,此外,SOD对蛋白质和核酸亦产生破坏作用。在保护酶系中,SOD能将超氧物阴离子自由基清除为过氧化氢,而CAT等保护酶的协调作用可进一步将H202,转变为水〔H20,从而使活性氧维持于一个较低水平[8][9]。过氧化氢是植物代谢中产生的一种产物,其积累对细胞具有氧化破坏作用。可根据其含量的变化,来了解组织的破坏程度。4、干旱胁迫下抗氧化酶〔POD和PPO含量的变化：PPO和POD均为植物内源自由基清除剂,属保护酶系统[10]。植物机体内存在抗氧化防御系统,而过氧化酶〔POD则是该系统的主要物质之一。逆境胁迫下,活性氧自由基增加,使植物细胞遭受氧活化胁迫。而POD对于消除细胞的活性氧对细胞膜的伤害,减少膜脂质过氧化,稳定膜的稳定性起到重要作用。多酚氧化酶〔PPO是存在于胞质溶胶和微体中的一种末端氧化酶,其活力很强,当细胞受轻微破坏、组织衰老、逆境下细胞活力降低,细胞结构有些解体时,PPO和酚接触,发生反应,可将酚氧化成棕褐色的醌,醌对微生物有毒,可防止植物感染。在水分胁迫时,胚芽鞘PPO和POD活性逐渐增强。这说明在干旱胁迫下,小麦胚芽鞘通过增强PPO和POD活性来抵御干旱逆境对其所造成的伤害,从而使小麦胚芽鞘可能获得较高的抗旱性。5、干旱胁迫下谷胱甘肽<GSH>含量的变化：在植物体内活性氧的清除包括酶系统与非酶系统,而谷胱甘肽〔GSH则是非酶系统中活性氧清除的重要抗氧化剂之一。谷胱甘肽〔GSH是由谷氨酸、半胱氨酸组成的天然三肽是一种含硫基的化合物。GSH不仅可以直接清除H2O2,在叶绿体中还可以与抗坏血酸协同作用清除H2O2。GSH值升高,说明GSH的亲核活性来消除活性氧和重金属等对细胞的伤害,在抗性作用中有重要作用[11]6、干旱胁迫下抗坏血酸<ASA>含量的变化：ASA是天然的非酶自由基清除剂[12],本实验中,ASA的含量增加,说明抗坏血酸对小麦的抗旱有着重要作用。ASA可以提高保护酶的活性,降低水分亏缺下超氧物阴离子自由基的产生,从而保护了膜系统,缓解了水分亏缺下叶绿素和蛋白质的分解破坏。提高了相对含水量,改善了水分状况,具有明显提高小麦抗旱性的生理效应。由实验结果可知,在干旱胁迫下,小麦幼苗的各项生理生化指标均有显著的变化,脯氨酸、过氧化氢、谷胱甘肽、抗坏血酸、丙二醛和可溶性糖浓度含量均明显增多,POP和POD活性也明显增强,说明干旱胁迫对植物有很大的影响。干旱对植物的伤害主要表现在一下几个方面：〔1各部位间水分重新分配。水分不同时,不同器官不同组织间的水分,按各部位的水势大小重新分配。水势高的部位的水分流向水势低的部位。〔2膜受损伤。缺水时,正常的膜双层结构被破坏,出现孔隙,会渗出大量溶质。脂质双层缺水时也会替换膜蛋白,与溶质一起渗漏,所以丧失选择透性,破坏细胞区室化,膜上酶的活性也丧失。〔3光合作用减弱。光合作用对缺水特别敏感。水分亏缺时,气孔开度减少甚至完全关闭,影响CO2的吸收,光合速率就下降。〔4渗透调节。植物缺水时另一个显著效应是由于溶质积累,而使渗透势下降。征对以上干旱对植物造成的伤害,所以我们应该采取相应的措施来提高植物