第三章转基因动物技术与药物生产

第三章转基因动物技术与药物生产当前1页，总共92页。基因工程技术按照人们的意志,通过人工操作的方式将外源基因整合到生物体基因组内,使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的实验技术。当前2页，总共92页。特点:基因体外重组不受生物种类的限制精确细致地控制当前3页，总共92页。外源目的基因的制备，外源目的基因有效地导入生殖

细胞或胚胎干细胞；选择获得携有目的基因的细胞，选择合适的体外培养

系统和宿主动物；转基因细胞胚胎发育及鉴定；筛选所得的转基因动物品系。关键技术包括：6.1转基因动物的原理和方法当前4页，总共92页。转基因技术目的基因的制备和来源目的基因的克隆细胞转染外源基因的方法转染细胞的鉴定6.2转基因技术当前5页，总共92页。1．采用限制性内切酶，获取目的基因2．通过mRNA合成cDNA3．人工体外合成DNA片断4．聚合酶链式反应(PCR)扩增特定基因片段目的基因的制备和来源6.2转基因技术当前6页，总共92页。目的基因的克隆（1）质粒载体基因克隆的载体（2）病毒类载体（λ噬菌体载体等）（3）粘粒载体（4）人工染色体6.2转基因技术当前7页，总共92页。质粒载体质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型有一定作用。质粒DNA不但能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核或真核细胞中均可复制的穿梭质粒，因此以质粒为载体的基因克隆方法被广泛使用。6.2转基因技术当前8页，总共92页。λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约有50kb，在λ噬菌体颗粒中分离出来的DNA为线性双链分子，在分子两端各有12个碱基的互补单链顺序，是天然的粘性末端。λ噬菌体功能相关基因成簇排列在基因组上，中间部分(约占30％)为非裂解生长所必须，根据这一特性，可用其他外源DNA片段插入或取代该区域，而对噬菌体的感染和生长不会造成严重影响。这是λ噬菌体成为重要的、有价值的基因克隆载体的基础所在。构建的重组λ噬菌体分子，其总长不得超过野生型DNA的105％，不能短于75％。病毒类载体（λ噬菌体载体等）6.2转基因技术当前9页，总共92页。粘粒(cosmid)是由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成，由于λ噬菌体载体容量仍然受到一定限制，最大插入片段不能超过23kb。1978年勘Collis和比Hohn发展了这类质粒与噬菌体联合的新载体——粘粒，其基因组一般由以下几部分组成：质粒复制起始位点，1个或多个限制性内切酶位点，抗药性标记和带有粘性末端的DNA片段。粘粒载体大小为4—6kb，而插入片段为29—45kb。粘粒载体6.2转基因技术当前10页，总共92页。人工染色体人工酵母染色体(YeastArtificialChromosome,YAC)人工细菌染色体(BacterialArtificialChromosome,BAC)6.2转基因技术当前11页，总共92页。染色体DNA的三种功能元件（functionalelements）自主复制DNA序列(autonomouslyreplicatingDNAsequence,ARS)着丝粒DNA序列(centromereDNAsequence,CEN)端粒DNA序列(telomereDNAsequence,TEL)6.2转基因技术当前12页，总共92页。人工酵母染色体法YAC能克隆百万对碱基的大片段DNAA.阳性ES细胞在YAC转染及体外筛选,囊胚腔注射B.YAC的原核微注射。技术途径：6.2转基因技术当前13页，总共92页。优点： A.保证大片段DNA的完整性 B.提高较长外源片段在动物转基因时的整合率 C.保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。6.2转基因技术当前14页，总共92页。人工酵母染色体（YAC）的制备6.2转基因技术当前15页，总共92页。6.2转基因技术当前16页，总共92页。6.2转基因技术当前17页，总共92页。细胞接受外源的方式6.2转基因技术当前18页，总共92页。细胞转染外源基因的方法：物理方法化学方法生物学方法6.2转基因技术当前19页，总共92页。物理方法电穿孔法微注射法裸露DNA直接注射法6.2转基因技术当前20页，总共92页。电穿孔法6.2转基因技术当前21页，总共92页。电穿孔法示意图6.2转基因技术当前22页，总共92页。微注射法6.2转基因技术当前23页，总共92页。微注射法示意图6.2转基因技术当前24页，总共92页。6.2转基因技术当前25页，总共92页。裸露DNA直接注射法将裸露DNA直接注射到组织中,DNA有可能被细胞摄入这是最简单的基因转移方法,但是转移效率很低6.2转基因技术当前26页，总共92页。化学方法主要原理是通过改变细胞膜的通透性或者增加DNA与细胞的吸附而实现基因的转移6.2转基因技术当前27页，总共92页。DEAE-葡聚糖法磷酸钙-DNA共沉淀法脂质体载体包埋法6.2转基因技术当前28页，总共92页。DEAE-葡聚糖法最早的动物细胞转染方法。将外源DNA片段与DEAE——葡聚糖等高分子碳水化合物混合，DNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAE的正电荷基团上，从而形成DNA大颗粒。后者黏附于受体细胞表面，并通过胞饮作用进入细胞内。该方法的转化率较低。6.2转基因技术当前29页，总共92页。磷酸钙-DNA共沉淀法是受二价金属离子能促进细菌吸收外源DNA而来.当核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式存在时,细胞摄取DNA的能力显著增加。6.2转基因技术当前30页，总共92页。磷酸钙-DNA共沉淀法图示6.2转基因技术当前31页，总共92页。脂质体载体包埋法6.2转基因技术当前32页，总共92页。脂质体载体包埋法图示6.2转基因技术当前33页，总共92页。生物学方法基因转移的生物学方法主要是病毒介导的基因转移。根据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为载体。目前常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病毒载体、牛痘病毒载体等）、反转录病毒载体等。6.2转基因技术当前34页，总共92页。腺病毒载体运载DNA片段较大安全性好宿主范围广对受体细胞分裂周期要求不严外源基因表达高效6.2转基因技术当前35页，总共92页。反转录病毒载体可获得稳定有效的转染可用于不易转化的细胞但有免疫反应,转染能力有限6.2转基因技术当前36页，总共92页。反转录病毒载体图示6.2转基因技术当前37页，总共92页。转染细胞的鉴定载体的抗药性选择DNA分子杂交法6.2转基因技术当前38页，总共92页。制备转基因动物的方法

转基因动物研究的核心技术是成功地把目的基因转入动物早期胚胎细胞中。目前，研究生产转基因动物的主要方法有基因显微注射法，胚胎干细胞移植法，反转录病毒感染法和精子载体导入法等。6.3转基因动物当前39页，总共92页。6.3转基因动物当前40页，总共92页。基因显微注射法6.3转基因动物当前41页，总共92页。显微注射DNA(目的基因)的构型、末端结构、长度与浓度、克隆载体和溶解DNA的缓冲液对目的基因的转移、整合及表达都有一定影响。

显微注射DNA的制备与纯化6.3转基因动物当前42页，总共92页。DNA构型和末端结构：线状与环状DNA均可用于转基因研究。线状DNA的末端结构差异(平末端、粘性末端)对整合效率与整合分子的结构影响不大。转移的DNA在染色体上的整合大多呈首尾相连的多拷贝，不同构型与末端间无明显差异。6.3转基因动物当前43页，总共92页。载体：原核克隆载体(如质粒)序列不影响携带基因的整合效率，但影响基因在转基因动物中的表达。注射前去除载体的基因，其表达水平显著高于保留载体的基因，且前者具有较好的重复性。对某些基因(如珠蛋白基因)，只有注射前去除载体才能得到组织特异性表达。6.3转基因动物当前44页，总共92页。留在核内的DNA溶液体积不明。DNA浓度易掌握，1ug/ml-3ug/mlDNA体积与浓度：6.3转基因动物当前45页，总共92页。溶解DNA的缓冲液：EDTA浓度需适中6.3转基因动物当前46页，总共92页。鼠的准备与要求母鼠——卵供体和假孕母鼠公鼠——正常、结扎6.3转基因动物当前47页，总共92页。6.3转基因动物当前48页，总共92页。卵供体母鼠：超排卵供体——4～6周鼠3—4周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理过程中易破裂。5周以后母鼠产卵逐渐减少。超排卵较好的母鼠每只每次产20—30个卵。6.3转基因动物当前49页，总共92页。公鼠性成熟约在6—8周，不同种系公鼠性维持时间不一，一般1—2年，但纯系公鼠只可使用8—10个月。每个公鼠需单笼饲养以免咬伤，饲养于2周后方可与超排卵母鼠交配。每个母鼠与1个公鼠交配，次日上午检查精栓，如两次以上都不能使母鼠有精栓，则需更换公鼠。为保证有足够的受精卵，公鼠最好每周只交配1次。6.3转基因动物当前50页，总共92页。假孕母鼠母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后的养母。这种母鼠在6周至5个月较适宜，体重最好大于20克，已产过仔并成功抚育过仔鼠的假孕母鼠最理想。6.3转基因动物当前51页，总共92页。6.3转基因动物当前52页，总共92页。超排卵与取卵4—6周母鼠在明暗循环的动物房内饲养3—5天，即可作超排卵，母鼠的性成熟程度是影响其超排卵的主要因素，一般在3—5周，卵泡成熟周期已开始，对卵泡刺激素(FSH)有反应的卵泡数达峰值。母鼠的不同种系其超排卵数也不同，这取决于其对FSH和LH(黄体生成素)的敏感程度，高敏种系每只鼠超排卵数可达40—60个，低敏种系不足15个。取卵：取卵全过程应尽快完成(1小时内)以减少暴露状态给卵带来的不利因素。6.3转基因动物当前53页，总共92页。6.3转基因动物当前54页，总共92页。需8周以上，无种系要求。在正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要先后使3只母鼠产生精栓且所有产生精栓的母鼠均未怀孕，然后才可用于与母鼠交配，产生假孕母鼠。

结扎公鼠6.3转基因动物当前55页，总共92页。6.3转基因动物当前56页，总共92页。显微注射6.3转基因动物当前57页，总共92页。6.3转基因动物当前58页，总共92页。6.3转基因动物当前59页，总共92页。卵的转移6.3转基因动物当前60页，总共92页。

转基因鼠的获得胚胎干细胞方法反转录病毒感染法精子载体法6.3转基因动物当前61页，总共92页。胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)是从早期胚胎内细胞团(ICM)分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能细胞。胚胎干细胞方法6.3转基因动物当前62页，总共92页。6.3转基因动物当前63页，总共92页。6.3转基因动物当前64页，总共92页。6.3转基因动物当前65页，总共92页。6.3转基因动物当前66页，总共92页。利用反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA上的高度整合特性，可以大大提高基因转移的效率。因此可以利用反转录病毒作为目的基因的载体，通过感染实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交，筛选即可获得转基因动物反转录病毒感染法

6.3转基因动物当前67页，总共92页。6.3转基因动物当前68页，总共92页。精子吸附DNA就使目的基因进入精细胞，再通过受精作用把目的基因传给子代动物，获得转基因动物。外源目的基因进入精细胞可通过与精子共育法、电穿孔导入法和脂质体转染法。精子载体法精子吸附DNA的方法6.3转基因动物当前69页，总共92页。受精技术精子在吸附外源性DNA后，即可以利用其进行受精，受精的方法及途径随着精子的处理方式及卵来源不同而有所不同6.3转基因动物当前70页，总共92页。人工授精壶腹部手术授精体外授精6.3转基因动物当前71页，总共92页。其他方法原始生殖细胞技术体细胞核移植技术逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞精子头与外源DNA合并注射卵母细胞6.3转基因动物当前72页，总共92页。6.3转基因动物当前73页，总共92页。6.3转基因动物当前74页，总共92页。6.3转基因动物当前75页，总共92页。转基因动物鉴定技术分子杂交斑点杂交聚合酶链式反应(PCR)原位杂交6.3转基因动物当前76页，总共92页。转基因动物的应用研究基因的结构与功能研究基因的组织特异性表达研究发育相关基因的表达与调控克隆在发育中起重要作用的基因基因多级调节系统的研究细胞功能的研究转基因动物在生命科学基础研究中的应用6.3转基因动物当前77页，总共92页。快速生长与肉质改良增强抗病性增加羊毛产量和性能抗冻品种培育优良动物品种育种在农牧业生产上的应用6.3转基因动物当前78页，总共92页。研究病毒性疾病研究建立人类疾病的转基因动物模型转基因动物与基因治疗生产天然活性药物蛋白转基因动物在医药研究领域中的应用

6.3转基因动物当前79页，总共92页。在异种器官移植中的应用建立异种抗原缺失或者表达水平低下的转基因猪建立HLA转基因猪建立人补体调节蛋白CD55,CD59等的转基因猪6.3转基因动物当前80页，总共92页。转基因动物应用面临的问题目的基因整合与表达的效率较低，或者引起宿主细胞基因突变。转基因动物的负面效应。研究费用高，需要相当的财力支持6.3转基因动物当前81页，总共92页。转基因生物反应器类型转基因微生物反应器转基因植物反应器转基因动物反应器动物乳腺生物反应器动物血液生物反应器其他生物反应器6.4转基因生物反应器当前82页，总共92页。转基因动物反应器从1987年，Gordon等，转基因小鼠组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA）1998年，3种转基因