基因工程学时

基因工程学时第一页，共二十六页，2022年，8月28日1基因工程概念：应用人工方法把生物的遗传物质（DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；或者使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。第二页，共二十六页，2022年，8月28日2①②③④⑤⑥基因工程技术的一般步骤第三页，共二十六页，2022年，8月28日3第一节基因工程理论的研究基础第二节基因工程基本技术路线第三节常用的工具酶和载体第四节目的基因片段的获取第五节目的基因导入受体细胞第六节克隆子的筛选和鉴定第四页，共二十六页，2022年，8月28日4第一节基因工程理论的研究基础染色体是遗传物质的载体。“基因”一词的创立：1909年，丹麦遗传学家约翰逊提出了“基因”（gene）一词。“基因型”与“表现型”术语，初步阐明基因与性状的关系。不过此时的基因仍是一个未经证实，仅靠逻辑推理得出的概念。第五页，共二十六页，2022年，8月28日5基因结构示意图＋链5’－链3’上游

3’5’第六页，共二十六页，2022年，8月28日6基因工程研究的理论依据：不同基因具有相同的物质基础基因是可以切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代第七页，共二十六页，2022年，8月28日7第二节基因工程的一般步骤生物材料RNADNAmRNAcDNA文库基因组文库人工合成目的基因克隆载体重组DNA受体细胞克隆子转基因生物第八页，共二十六页，2022年，8月28日8第三节常用的工具酶和载体

3.1工具酶（一）限制性核酸内切酶：

(二）DNA连接酶：（三）DNA片段末端修饰酶：

(四)DNA聚合酶第九页，共二十六页，2022年，8月28日9(一)限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）（1）限制性核酸内切酶定义一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具有3’－OH和5’－P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶。第十页，共二十六页，2022年，8月28日10（2）限制性核酸内切酶种类I型酶：它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链II型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带III型酶：它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。

第十一页，共二十六页，2022年，8月28日11根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写该微生物种名前的2个字母第四个字母大写有变种或品系的第一个字母罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ从一种微生物中发现了几种限制酶，按发现顺序排列

如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichiacoli）R株分离得到的第一种限制酶。（3）限制性核酸内切酶的命名第十二页，共二十六页，2022年，8月28日12HindIIIHaemophilusinfluenzaed属名种名株名嗜血流感杆菌d株发现的第三种限制性内切酶第十三页，共二十六页，2022年，8月28日13

（4）限制性内切酶作用模式图：（a)产生5′突出粘性末端(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA

5′3′3′5′—OH—P

AATTC*********

G*********5′3′3′5′P

OH—第十四页，共二十六页，2022年，8月28日14

(b）产生3′突出粘性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********第十五页，共二十六页，2022年，8月28日15

(c）产生平末端(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************第十六页，共二十六页，2022年，8月28日16常用的限制性内切酶RsaI GTAC CATG BamHI GGATCC CCTAGGNotI GCGGCCGC CGCCGGCGEcoRV GATATC CTATAG 5‘3‘第十七页，共二十六页，2022年，8月28日17(6)常用的酶切方法：单酶切双酶切部分酶切：底物浓度低，识别序列的甲基化，酶用量不足，反应时间不够以及反应缓冲液(5)酶切反应体系第十八页，共二十六页，2022年，8月28日18（二）DNA连接酶

DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶。催化两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。第十九页，共二十六页，2022年，8月28日19(1)DNA片段之间的连接（a）具有互补粘性末端片段之间的连接：

T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶

（b）具有平末端DNA片段之间的连接：

T4DNA连接酶；

第二十页，共二十六页，2022年，8月28日20（c）DNA片段末端修饰后进行连接：核酸外切酶：切成平末端末端转移酶：修饰成互补黏性末端碱性磷酸酶：将5’-P修饰成5’-OH（d）DNA片段加连杆后连接人工合成连杆或衔接头第二十一页，共二十六页，2022年，8月28日21

EcoRI**********GAATTC********************CTTAAG**********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********

G*********5′3′3′5′

—P

OH—DNA连接酶（2）作用模式图：a）连接粘性末端第二十二页，共二十六页，2022年，8月28日22

b）连接平末端AluI*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************T4DNA连接酶第二十三页，共二十六页，2022年，8月28日23（三）DNA片段末端修饰酶*

末端脱氧核苷酸转移酶：

使DNA片段平末端的3‘-OH加上同聚核苷酸，产生具有poly(A、T、G、C)的粘性末端，通过DNA连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接*核酸外切酶：

切去DNA片段的凸出末端，使成为平末端*碱性磷酸酶：

为防止DNA片段末端之间的连接，常采用碱性磷酸酶处理，使DNA末端的5’－P成为5’-OH.第二十四页，共二十六页，2022年，8月28日24（四）DNA聚合酶（1）要有底物4种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前体催化合成DNA;（2）必须有模版；（3）需有引物，不能自行其起始合成新的DNA链；（4