核酸的生物合成详解

核酸的生物合成详解演示文稿当前1页，总共91页。（优选）核酸的生物合成当前2页，总共91页。中心法则大多数生物的遗传物质DNA和某些病毒的遗传物质RNA，通过复制把亲代的遗传信息传递到子代。DNA中的遗传信息还可以传递到RNA中（转录），并通过RNA再传递到蛋白质中（翻译）。在个别生物中遗传信息可以由RNA传递到DNA，即反转录。

当前3页，总共91页。第十四章核酸的生物合成当前4页，总共91页。基本要求：

（1）掌握中心法则、DNA复制的基本过程及参与的酶和蛋白、逆转录、RNA的转录及其加工、DNA重组技术和PCR技术（2）理解原核与真核生物DNA复制的差异、核酸合成的抑制剂（3）了解RNA的复制、突变和修复的种类、基因工程的应用教学重点及难点：（1）DNA复制的基本过程及忠实性的保证、逆转录、RNA的转录及其加工（2）DNA的重组技术当前5页，总共91页。一、DNA的生物合成1.DNA的复制2.反转录作用3.DNA的损伤、修复与突变蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA当前6页，总共91页。1.DNA的复制基因组（genome）：含有一个生物体生存、发育、活动和繁殖所需要的全部遗传信息的整套DNA（部分病毒是RNA）。DNA复制(replication)：在亲代双链DNA分子每一条链上按碱基互补配对而准确地合成一条新的互补链，结果生成两个与亲代链相同DNA双链的过程。当前7页，总共91页。1.1DNA半保留复制复制过程中双螺旋解旋并分开，然后以每条链为模板，按碱基互补配对原则，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基序列完全相同。由于每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。当前8页，总共91页。Meselson&

Stahl1958年利用同位素15N标记的大肠杆菌DNA首先证实。DNA的半保留复制使生物的遗传特性保持稳定性。DNA的半保留复制的证据当前9页，总共91页。1.2DNA半不连续复制复制叉前导链、后随链冈崎片段在DNA复制过程中，前导链的连续复制和滞后链的不连续复制，称为DNA的半不连续复制。当前10页，总共91页。当前11页，总共91页。1.3大肠杆菌DNA复制的酶及相关因子DNA复制需要：DNA模板，四种dNTP，离子环境，酶，相关因子。(1)DNA聚合酶(DNAPolymerases)DNA聚合酶的性质：①以dNTP为前体催化合成DNA；②需要模板和引物的存在；③不能起始合成新的DNA链；④催化dNTP加到生长中DNA链的3’-OH末端；⑤催化DNA合成的方向是5’→3’。当前12页，总共91页。模板链引物链（提供一个自由的3’-OH）碱基互补当前13页，总共91页。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1956年ArthurKornberg发现（1959年获诺贝尔奖）100公斤细菌中得到0.5克纯酶。故称Kornberg酶。全酶:单链多肽；109kD；含1个Zn2+；枯草杆菌蛋白酶处理可分解为1大（Klenowfragment）和1小两个片段。大片段（C端）：具有5′→3′聚合酶活力3′→5′外切酶活力小片段（N端）：具有5′→3′外切酶活力当前14页，总共91页。DNApolⅠ不是大肠杆菌中DNA复制的主要酶。体内DNA合成速率比纯化的DNApolⅠ催化dNTP掺入速率(667nt/min)高20倍；b.大肠杆菌的一个突变株中，DNApolⅠ活力正常，但染色体DNA复制不正常；c.在一些突变株中,DNApolⅠ活力只是野生型的1%，但DNA复制正常,而此突变株对辐射和化学诱变剂却高度敏感。DNApolⅠ在DNA损伤修复和切除RNA引物中发挥作用。当前15页，总共91页。1970年发现DNApolⅡ。MW：120KD，DNApolⅡ具5’→3’聚合活性，仅为DNApolⅠ的5%。DNApolⅡ具3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外切酶活性。DNApolⅡ缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制正常。表明DNApolⅡ不是DNA复制的主要酶，它可能在DNA损伤修复中起一定作用。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ当前16页，总共91页。DNApolⅢ至少以10种亚基组成的复合物形态存在。全酶形成一个非对称的二聚体，含两个核心酶，这种结构可使两条新合成的DNA链一同被复制。催化dNTP掺入DNA链速率是DNApolⅠ的15倍。其中,,θ三个亚基构成核心聚合酶(corepolymerase)。DNApolⅢ具有5’→3’聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性(

亚基)，但无5’→3’外切酶活性。DNApolⅢ才是大肠杆菌DNA复制的关键酶。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ当前17页，总共91页。大肠杆菌三种DNA聚合酶的比较polIpolIIpolIII分子量103Kd88Kd830Kd每个细胞的分子数40010010~20生物学活性10.05155'→3'聚合酶活性＋＋＋3'→5'外切酶活性＋＋＋5'→3'外切酶活性＋－－功能

校正，修复，去除RNA引物修复复制（5'→3'聚合作用）当前18页，总共91页。引物酶（又称DnaG蛋白）作用：以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸合成RNA作为DNA合成的引物。大肠杆菌引物酶：由大肠杆菌的dnaG基因编码的1条多肽链，MW：60KD，50-100分子/细胞。引物酶与DnaB、DnaC、DnaT、PriA、PriB、PriC等蛋白组成引发体才有活性，这种复合体称为引发体。(2)引物酶(Primase)和引发体(primosome)当前19页，总共91页。DNA连接酶催化双链DNA中一条链上的断点的共价连接（磷酸二酯键的形成）。借助ATP（真核细胞）或NAD+（大肠杆菌）水解提供能量。两条链必须与同一条互补链配对结合，而且断点上的3’-OH和5’-磷酰基必须相邻。DNA连接酶催化反应可逆。逆反应使共价闭环超螺旋DNA产生有缺口DNA-腺苷酸，生成松弛闭环DNA。连接酶在DNA复制、修复、重组中起重要作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。（3）DNA连接酶(DNAligase)当前20页，总共91页。(4）DNA解旋酶（Helicase）一般通过水解ATP提供能量将DNA两条链沿5’→3’方向打开(一般与单链结合)。复制叉当前21页，总共91页。（5）单链结合蛋白SSB解旋酶沿复制叉方向推进产生一段单链区,细胞内有大量ssDNA结合蛋白(singlestrandDNAbindingprotein,SSB)，这类单链结合蛋白结合到由解螺旋酶解链作用而形成的单链DNA上，使其稳定下来。

当前22页，总共91页。（6）拓扑异构酶（DNATopoisomerase）Ⅱ型拓扑异构酶通过断裂和连接两条DNA链而改变DNA双螺旋结构，该过程需要水解ATP功能。Ⅰ型拓扑异构酶通过断裂和连接双链DNA中的一条链而改变DNA的超螺旋结构，该反应不需要ATP功能。当前23页，总共91页。DNA双链′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶与引发体DNA连接酶引物当前24页，总共91页。拓扑异构酶与DNA双链结合，解开超螺旋。′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物引物酶与引发体当前25页，总共91页。拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物解旋酶解开DNA双螺旋′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质引物酶与引发体当前26页，总共91页。单链结合蛋白防止复螺旋′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物引物酶与引发体当前27页，总共91页。引物酶合成引物′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物引物酶与引发体当前28页，总共91页。′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物引物酶与引发体当前29页，总共91页。1.4原核生物的DNA复制DNA复制的起始；DNA链的延长；DNA复制的终止当前30页，总共91页。当前31页，总共91页。1.4.1复制的起始复制起点（Originofreplication，Ori）复制泡（replicationbubble）复制叉（Replicationfork）复制子（Replicon,复制单元）—DNA复制的功能单位，一个复制子只含一个专一复制起点和复制结束的终点。一个完整的复制子在一个细胞周期中只复制一次。细菌病毒和线粒体只有单一复制子。真核生物染色体则有多个复制子组成。当前32页，总共91页。当前33页，总共91页。大肠杆菌复制的起点由245个bp构成，其序列很保守，有两组短的重复：

3个13bp的序列和4个9bp的序列当前34页，总共91页。20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。解螺旋酶（DnaB）在DnaC协助下与开放复合物结合，进一步解链。解链时带来的扭曲张力还需DNA旋转酶（属DNA拓扑异构酶Ⅱ）引入负超螺旋消除。当前35页，总共91页。单链结合蛋白(SSB）结合在单链区，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。引物合成酶（DanG）催化合成最初的RNA引物。引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子构成的复合体（引发体），以DNA为模板合成RNA引物（6-10个碱基）。当前36页，总共91页。复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引物在DNA聚合酶III的催化下，以脱氧核糖核苷酸为底物，在RNA引物的3′端加上脱氧核糖核苷酸。

1.4.2DNA链的延伸当前37页，总共91页。DNA链的延伸以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是3′5′走向，与之互补的DNA能以5′3′的方向连续合成，称为前导链（领头链）。另一条模板链是5′3′走向，与其互补的DNA也是5′3′方向合成，与复制叉移动方向正好相反，随复制叉的移动，形成许多不连续的片断，称为冈崎片断。每个冈崎片段的合成也都需要引物。当前38页，总共91页。复制体沿着复制叉方向前进，同时进行前导链和滞后链的合成。一分子的DNApolIII.协同合成前导链和滞后链，因此滞后链必须绕成一个突环。5’3’3’5’当前39页，总共91页。E

E.coli有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白-tus，识别

序列一：terEterDterA

序列二：terFterBterC共6个终止位点。1.4.3DNA合成的终止当前40页，总共91页。每个区域只对一个方向的复制叉起作用Tus蛋白-ter复合物阻止一个方向的复制叉前移(通过抑制DNA解旋酶而发挥终止作用)当前41页，总共91页。终止两个复制叉向前移动，最后在终止区相遇并停止复制，由DNA聚合酶Ⅰ填补空隙，最后由连接酶封口。结果形成两个DNA双股螺旋分子。当前42页，总共91页。原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的移动方向拓扑异构酶DNA聚合酶III解旋酶RNA引物引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5´RNA引物3´3´DNA连接酶当前43页，总共91页。DNA聚合酶的5’-3’聚合酶活性部位对底物有选择作用（区分NTP和dNTP）；具有3΄→5΄外切酶活性的DNA聚合酶是保证DNA复制真实性的主要因素；复制时使用RNA引物而不是DNA引物；具有多种修复被损坏的DNA的机制。1.4.4DNA复制具有高度保真性当前44页，总共91页。1.5真核细胞的DNA复制

真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。冈崎片段长约200bp。真核生物DNA复制速度比原核慢。真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。真核生物有多种DNA聚合酶。真核生物线性染色体两端有端粒结构。当前45页，总共91页。1.5.1染色体复制真核生物每一个染色体皆含有多个复制子(replicon).复制叉前进的速度大约只有大肠杆菌的十分之一。当前46页，总共91页。真核细胞的DNA聚合酶引物合成修复作用线粒体DNA的复制核DNA的复制修复作用当前47页，总共91页。1.5.2端粒的复制真核生物线状染色体在复制最后，5′末端RNA引物被切除后，无法向原核那样填补空缺，如果没有特殊的机制合成末端序列，将造成5′末端序列缩短，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。端粒（telomere）：指真核细胞线状染色体末端的DNA重复序列及相关蛋白组成的复合物。端粒酶（telomerase）：由RNA和蛋白质组成的一个复合物，以端粒酶中的RNA（有特殊的序列）为模板，通过反转录合成端粒DNA。

当前48页，总共91页。端粒有两种功能：①维持染色体的完整性。若无端粒，两个染色体末端很可能融合一起。②解决末端复制问题。端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。当前49页，总共91页。1986年，HowardCooke首先注意到，端粒的长度在体细胞内比在生殖细胞内短。进一步的研究发现，端粒酶活性在生殖细胞内经常被表现出来，所以端粒的长度一直保持在15kb右。端粒酶与老化大多数体细胞不制造端粒酶，每次分裂后端粒就变短(大约100bp)。当端粒比正常长度短数千个碱基对，细胞就不再分裂。所以端粒变短是一种老化的象征。已经有实验证明，将端粒酶加进体细胞，可以增加体细胞分裂的次数。癌细胞的端粒酶活性很强。端粒酶可被应用到与老化相关的疾病。当前50页，总共91页。卡罗尔·格雷德（CarolGreider）杰克·绍斯塔克（JackSzostak）伊丽莎白·布莱克本（ElizabethBlackburn）端粒和端粒酶的发现共获2009年诺贝生理医学奖当前51页，总共91页。2.反转录作用以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA称为逆转录，由反转录酶催化进行。1970年Temin和Baltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。后来在胚胎细胞和正常细胞中也分离得到了这种酶，反转录酶的发现使中心法则更完善。复制DNA转录反转录RNA翻译蛋白质当前52页，总共91页。1962年HowardTemin提出假设。他认为致癌RNA病毒含有一种能将RNA转录成DNA的酶。1970年Temin和DavidBaltimore证实了致癌RNA病毒中有这种酶的存在，因此Temin1975年获诺贝尔奖。当前53页，总共91页。多功能的反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶HDNA指导的DNA聚合酶当前54页，总共91页。RNA进入细胞逆转录RNA整合入宿主细胞染色体DNA衣壳被膜逆转录酶丢失被膜丢失衣壳RNAcDNA逆转录病毒的生活周期当致癌RNA病毒侵染宿主细胞时，病毒RNA及逆转录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入的逆转录酶使RNA逆转录成双链DNA。转录转译衣壳蛋白被膜蛋白逆转录酶病毒粒子当前55页，总共91页。3.DNA损伤、修复和突变3.1DNA的损伤与修复DNA分子的自发性损伤(体内)①DNA复制中的错误②DNA的自发性化学变化物理因素引起的DNA损伤（外界）①紫外线引起的DNA损伤②电离辐射引起的DNA损伤化学因素引起的DNA损伤（外界）①烷化剂对DNA的损伤②碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤当前56页，总共91页。嘧啶二聚体的修复当前57页，总共91页。（1）光裂和酶修复作用:形成酶－DNA复合物：光复合酶结合于损伤部位酶被可见光所激活修复后释放酶5'3'5'3'hυ当前58页，总共91页。（2）切除修复:当前59页，总共91页。（3）重组修复（复制中）:当前60页，总共91页。3.2DNA突变DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。DNA在复制的保真度很高，只有10-10-10-9自的错配率，所以说自然条件下发生的突变率非常低（自发突变）。某些物理化学因素，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂（烷化剂、碱基类似物、嵌入染料）等，可引起突变（诱发突变）。当前61页，总共91页。转换野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-颠换碱基对的置换/点突变

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C--T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-插入或缺失非3个碱基

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T移码突变当前62页，总共91页。二、RNA的生物合成蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA中心法则示意图？当前63页，总共91页。转录是在DNA指导的RNA聚合酶催化下，按照碱基互补配对的原则，以4种NTP为底物，不需要引物，连续合成出一条与DNA一条链互补的RNA的过程。转录起始于DNA的特定位点，并在一定位点处终止，此转录区域称为转录单位。转录方向-5’-3’转录起始-启动子区控制转录终止-终止子区控制1.转录(transcription)当前64页，总共91页。当前65页，总共91页。模板链/反义链/负（-）链编码链/有义链/正（+）链编码链上转录起点标记为+1，上游标记为负，下游标记为正1.1不对称转录当前66页，总共91页。1.2RNA聚合酶当前67页，总共91页。大肠杆菌的RNA聚合酶结构复杂,全酶由5个亚基构成α2ββ’

ωσ，还含有两个Zn2+。α2ββ’为核心酶。NTP结合部位DNA模板结合部位β亚基结合位点带领核心酶识别启动子可能参与各亚基组装成RNA聚合酶当前68页，总共91页。1.3转录过程转录过程分为起始、延伸、终止。当前69页，总共91页。识别：RNA聚合酶与启动子的结合，DNA链的局部打开。起始：DNA模板和RNA碱基配对第一个核苷酸通常是ATP或GTP①RNA合成的起始当前70页，总共91页。当前71页，总共91页。②RNA链的延伸RNA聚合酶是沿DNA链3’→5’方向移动RNA链合成方向也是5’→3’RNA聚合酶缺乏核酸外切酶活性，即缺乏校对功能当前72页，总共91页。③RNA合成的终止基因转录终点-终止子(terminator)终止子是基因末端终止转录的特殊信号序列。RNA聚合酶和新合成的RNA从DNA上脱落。当前73页，总共91页