微生物遗传育种绪论下

四真核基因表达调控当前1页，总共67页。

真核基因的表达调控系统与原核的区别：1、真核基因数目多，哺乳动物有数万～10万，而E.coli仅有40002、大量重复序列，可能对基因的表达带来影响3、真核DNA与组蛋白组成核小体结构，并有许多非组蛋白结合。组蛋白、非组蛋白和核小体的组织状态及核小体的超螺旋结构影响基因的活性。当前2页，总共67页。

4、真核基因有内含子，转录的mRNA都要经拼接加工，细胞可通过对mRNA前体的加工与否进行调节。5、真核基因转录在细胞核，翻译在胞浆，排除了转录衰减。6、真核mRNA寿命长，脊椎动物mRNA平均半寿期大约为3小时。7、调控范围大：DNA水平—转录水平—转录后水平—翻译水平—翻译后水平等多层次的调控。当前3页，总共67页。（一）转录水平的调控

主要通过反式作用因子，顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的。当前4页，总共67页。

1、基因转录水平的顺式作用元件

顺式作用元件（cis-actingelements）:指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因，同时，这种DNA序列通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中。按功能分启动子、增强子和沉默子。当前5页，总共67页。

1、启动子（promoter）

与基因表达启动相关的顺式作用元件，位于基因转录起始点上游。根据启动子中TATA盒的有无分典型的启动子和不典型的启动子。当前6页，总共67页。

①典型的启动子：

含TATAbox，有时一个基因的启动子上有两个TATAbox，它们可分别或有侧重地对不同诱导物作出应答，在某些情况下，也参与组织特异性的选择，如-淀粉酶基因在唾液腺和肝脏两种组织分别选择了相距2.8kb，转录效率不同的两个转录起始点，保证唾液中酶的活性远高于肝脏。当前7页，总共67页。

②不典型的启动子：

不含TATAbox，通常含GC序列，如管家基因的启动子。含这类启动子的结构基因转录起始往往是不规则的，并且只有基础水平的表达。当前8页，总共67页。

2、增强子(enhancer)

使基因转录速率显著提高的一类顺式元件。增强子主要通过改变DNA模板的螺旋结构、为DNA模板提供特定的局部微环境、或为RNA聚合酶和反式作用因子提供一个与某些顺式元件联系的结构等方式发挥作用。作用特点：无自身方向性及基因特异性，也不受与基因距离远近的影响。3、沉默子(silencer)使基因转录降低或使基因关闭的一类顺式作用元件当前9页，总共67页。

2、基因转录调节的反式作用因子1、反式作用因子的定义

Trans-actingfactor：是能直接或间接地识别或结合在各顺式元件的核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组序列特异性的DNA结合蛋白。当前10页，总共67页。

2、反式作用因子的特点⑴具有三个功能域：DNA识别结合域，转录活化域，调节结构域⑵具有识别启动子和增强子的功能⑶对调节有正向和负向两个方面当前11页，总共67页。

3、反式作用因子结构域的模式⑴DNA结合域①锌指结构(Zincfingermotif):DNA结合域中由2个Cys和2个His或4个Cys与一个锌离子借配位键结合成的指状结构。如TFⅢ-A有9个重复的指结构，类固醇激素受体家族有2个指结构。当前12页，总共67页。最常见的DNA结合域：

1、锌指（zincfinger）C——CysH——His常结合GC盒当前13页，总共67页。

②碱性-螺旋结构

如CTF是结合CCAAT盒的一种转录因子，其DNA结合域具有-螺旋，并富含碱性氨基酸。当前14页，总共67页。

2、α-螺旋常结合CAAT盒当前15页，总共67页。

③同源结构域(Homodamain)：反式作用因子中由约60个左右氨基酸的相同保守序列组成的螺旋-转折-螺旋的区域。这类反式作用因子的DNA结合域至少有两个-螺旋，两螺旋之间由几个氨基酸残基形成的“转折”。当前16页，总共67页。当前17页，总共67页。

④螺旋-环-螺旋能与免疫球蛋白链基因增强子结合的反式因子E12和E47羧基端100～200aa可形成两个两性-螺旋，两螺旋之间为非螺旋的环，-螺旋氨基端有碱性区，这个碱性区对结合DNA是必须的，-螺旋对形成二聚体是必须的。当前18页，总共67页。当前19页，总共67页。

⑤亮氨酸拉链(Leucinezipper)两个具有亮氨酸拉链区的反式作用因子以疏水力相互作用形成的形同拉链的区域。

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⑵转录活化域(transcriptionalactivationdomain)

位于DNA结合域以外由80～100个aa组成的具有转录活化功能的区域。当前21页，总共67页。

①带负电荷的-螺旋结构含较多酸性氨基酸能形成亲脂的-螺旋，称酸性-螺旋结构。如糖皮质激素受体的转录活化域，Jun转录因子的转录活化域等。作用：对转录起始的特异诱导活性相对较低。可与TF-ⅡD复合物中某个通用因子或RNApol结合而发挥作用。当前22页，总共67页。

②富含谷氨酰胺结构

如SP1是与启动子GCbox结合的一种转录因子，除有结合DNA的锌指结构外，SP1共有4个参与转录活化的区域，其中最强的转录活化域之一很少有极性aa，却富含谷氨酰胺，达该区aa总数的25%左右。Oct1/2，Jun,AP2,SRF均含此区域。当前23页，总共67页。

③富含脯氨酸结构

如CTF-NF1转录因子的羧基端很难形成-螺旋，原因是此区域富含脯氨酸，占该区aa的20～30%，在Oct2，Jun，AP1，SRF等哺乳动物因子中也有富含脯氨酸的结构当前24页，总共67页。

⑶调节结构域

如糖皮质激素受体是一种反式作用因子，它有与糖皮质激素结合的区域，这个区域称调节结构域。当前25页，总共67页。

3、基因转录调控中蛋白质与DNA及蛋白质与蛋白质的相互作用1.蛋白质与DNA的相互作用—非共价键相互作用1)氢键:供氢基团:G,A,C的氨基受氢体:Glu,Asp的残基侧链2)疏水键:DNA分子大沟侧缘的T的-CH3与疏水性氨基酸等均可建立疏水键联系。3)碱性氨基酸残基与DNA分子中戊糖-磷酸骨架之间建立电荷联系当前26页，总共67页。

2.蛋白质与蛋白质的相互作用—非共价键相互作用1)氢键:蛋白质分子中带部分正电性的氢原子与带电负性的原子靠静电相互作用形成氢键。如NH3,-NH2,-OH的氢带部分正电性,-C=O,-C00-带负电性2)离子键:存在于两个完全或部分带相反电荷的原子或基团之间的相互作用力。主要发生在碱性氨基酸侧链,N-末端自由氨基,酸性氨基酸侧链及C-末端羧基等带电基团之间3)疏水相互作用:主要发生在疏水性氨基酸侧链之间当前27页，总共67页。4、转录起始的调控机制解除组蛋白对基因的封闭作用;反式作用因子活性的调节顺式作用元件与反式作用因子的相互作用。当前28页，总共67页。

带正电荷的组蛋白与DNA中带负电荷的磷酸基结合,于是组蛋白遮蔽了DNA分子,降低了DNA的模板活性。组蛋白的修饰作用可明显解除染色体的抑制作用。已证明高乙酰化组蛋白特异地聚集于活性染色质功能区,低乙酰化组蛋白聚集于无转录活性的非功能区,这一结果表明组蛋白乙酰化可激活转录。此外,核小体组蛋白乙酰水平升高,可使DNA－组蛋白抑制性结构破裂,有利于基本转录因子与转录起始部位结合。组蛋白对基因的封闭作用当前29页，总共67页。蛋白质与DNA结合时主要是DNA结构发生变化,DNA柔性加强了蛋白质－DNA的相互作用,识别螺旋沿DNA大沟,在大沟一侧接触到碱基,接触碱基数目一般不超过5bp。识别螺旋的氨基酸残基分为3类:(1)与DNA碱基接触的残基,大多是极性的;(2)与主链磷酸基因接触的残基,大多是碱性的;(3)与蛋白质其余部分接触的残基,往往以疏水残基背向DNA。顺式作用元件与反应作用因子的相互作用当前30页，总共67页。

体外转录器组装的第一步即为TFⅡD结合到TATA盒上,形成包括TATA结合蛋白和约10个TBP相关因子的复合物。是TFⅡD还是TBP还是两者同时结合TATA盒尚不清楚。体外转录试验表明,TAFs在对激活因子的应答中起作用。TFⅡD和TBP在基础转录中含量相似,但只有TFⅡD能对激活剂产生应答。而且不同物种的活性结构域是和特异性的TAFs相互作用的。激活蛋白能刺激TFⅡD－TFⅡA－TATA复合物形成,活性结构和TAFs的多重接触能增强TFⅡD与TATA盒的结合,激活转录。TFⅡD中心论当前31页，总共67页。

1、反式作用因子的活性调节⑴表达式调节

这类反式作用因子合成出来就有活性，需要时就合成，不需要时就降解失活。当前32页，总共67页。

如STAT家族(Signaltransducersandactivatorsoftranscription)。

⑵共价修饰这类反式因子合成出来没有活性，需要修饰才具有活性，如是磷蛋白则通过磷酸化与去磷酸化调节其活性；如是糖蛋白，则通过糖基化与去糖基化调节其活性。当前33页，总共67页。

⑶配体结合

许多激素受体是反式作用因子，本身对基因转录无调节作用，由激素激活后具有表达调控作用。当前34页，总共67页。

⑷蛋白质与蛋白质的相互作用有些反式作用因子单独不能发挥作用，需与另一种蛋白结合成复合物才能发挥作用，如C-myc蛋白单独结合DNA的能力很低，与max蛋白结合成二聚体就可调节基因表达。当前35页，总共67页。

2、反式作用因子与顺式元件结合

反式作用因子有激活基因表达的反式作用因子和阻遏表达的反式作用因子，值得一提的是：有些反式因子先激活，再与DNA结合，少数反式作用因子先与DNA结合，再被激活。当前36页，总共67页。

3、反式作用因子的作用方式⑴成环假说

位于不同DNA结合位点上的两个蛋白质通过两个结合位点之间DNA弯曲成环，而彼此靠近，直接接触而发挥作用。如一个反式因子与增强子结合，RNApol与启动子结合，通过DNA柔曲性，弯曲成环使两个蛋白质靠近，为它们的相互作用提供条件。当前37页，总共67页。

当前38页，总共67页。

⑵滑动假说一种反式因子结合DNA的特定序列后，沿着DNA滑动到另一个特定序列并与那里的蛋白质发生相互作用促进转录的起始。⑶扭曲假说反式因子与DNA结合时，DNA发生变形，这种构型的改变可使DNA解旋，有利转录的起始。当前39页，总共67页。

⑷接力假说一个反式因子与DNA特定序列结合，促进另一种蛋白质结合于相邻的DNA序列，由此再促进别的蛋白质的结合，最后一直伸展到转录起始位点，对转录产生调控作用。在短距离内，这种机制是可能的，但远距离无法采用这种机制。当前40页，总共67页。

4、中介因子在转录起始调节中的作用

许多核受体与通用转录因子之间并不直接相互作用,而是通过中介因子在核受体与通用转录因子之间发挥作用。如CBP在CREB(cAMPresponseelementbindingprotein)与通用转录因子(TFⅡB)之间发挥作用。当前41页，总共67页。

第一类为RNA聚合酶II(polII)和基本转录因子(GTFs),它们结合在靶基因的启动子上,形成前起始复合物(PIC),启动基因的转录;第二类为调节蛋白(如激活因子和抑制因子),它们是一类与靶基因启动子和增强子特异结合的转录因子,具有细胞及基因特异性,可以增强或抑制靶基因的转录;第三类是协调因子,协调因子分为协同激活(抑制)因子和中介因子二类：它们往往在转录因子和前起始复合物之间发挥桥梁作用。另外,这些因子还可以改变局部染色质的构象,对基因转录的起始具有推动作用。参与转录过程的蛋白因子:当前42页，总共67页。

中介因子是多亚基的复合体,酵母中介因子复合体由20多种蛋白组成（一)中介因子在激活基因转录中的作用中介因子复合体可与转录因子直接作用。但不同的转录因子可能与同一复合体的不同亚基相互作用。例如,干扰素(IFN)介导的基因转录的激活需要中介因子复合体DRIP的参与;在核受体激活基因转录时,DRIP/TRAP复合体是通过DRIP205/TRAP220与核受体来直接作用中介因子复合体的组成及作用机制当前43页，总共67页。

(二)中介因子对转录的抑制作用各种中介因子在基因转录调控中的作用不尽相同。中介因子DRIP、ARC、CRSP、SUR2的主要功能是激活基因转录,NAT可以抑制转录,而TRAP/SMCC在不同条件下既可以活化转录又可以抑制转录中介因子复合体的组成及作用机制当前44页，总共67页。

5、反式作用因子的组合式调控

几种反式作用因子通过组合共同完成基因的表达调控。如有A、B、C三种反式因子结合A基因的调控区，其中A、C两种因子起正调控，B因子起负调控，其综合效应则是激活转录，又如有A、B、D三种因子结合B基因的调控区，其中A起正调控，B、D起负调控，其综合效应则抑制B基因的转录。当前45页，总共67页。当前46页，总共67页。

6、转录起始复合物的形成

在转录起始复合物的形成过程中，RNApol与启动子结合都是关键的一步。细菌的RNApol识别的是一段DNA序列，真核生物RNApol识别的不是单纯的DNA，是由转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，真核生物有3种RNApol，分别识别不同的启动子，转录不同的产物，需不同的转录因子。当前47页，总共67页。当前48页，总共67页。（三）转录后水平的调控当前49页，总共67页。

（一）5′端加帽和3′端加多聚腺苷酸化的调控意义加帽和Poly(A)尾不是mRNA稳定的唯一因素，但是十分重要的因素。这两个因素至少保证mRNA在转录过程中不被降解。核糖体在核内组装，rRNA受到蛋白质的保护而不被降解。tRNA在合成后，形成特殊的空间结构可抵抗降解。mRNA如果没有5′帽和3′poly(A)尾，在合成过程中就会被迅速降解。当前50页，总共67页。

（二）mRNA的选择性剪接对基因表达的调控作用1、mRNA的选择剪接真核细胞的剪接过程中，参加拼接的外显子可以不按其在基因组的线性分布次序拼接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的mRNA中是可选择的，这种剪接方式称为选择剪接(alternativesplicing)。⑴外显子选择(optionalexon)⑵内含子选择(optionalintron)⑶互斥外显子（mutuallyexclusiveexon）⑷内部剪接位点(internalsplicesite)当前51页，总共67页。

当前52页，总共67页。

(三)mRNA运输的控制mRNA的运输是受到控制的。成熟的mRNA大约只有20%的mRNA进入胞浆，留在核内的RNA约在1小时内降解成小片段。mRNA通过核膜的运输是一个主动运输过程，核膜上的核孔是大约9-nm的通道，但可以运输大于9nm的颗粒，如核糖体（15nm）。核糖体均在核内组装，再运输到胞浆。RNA从核运输至胞浆的运输的调控机理目前还不清楚。当前53页，总共67页。（四）翻译水平的调控当前54页，总共67页。

1、翻译起始的调控1、5′帽子结构（m7GpppN）对翻译的调控作用①m7G帽有增强翻译效率的作用②5′帽子结构有利于mRNA从细胞核向细胞质转运和增加其稳定性③5′帽子结构与3′poly(A)尾对mRNA的翻译效率的调节有协同作用当前55页，总共67页。

2、5′AUG对翻译的调控作用翻译时，90～95%的真核mRNA符合第一AUG规律。某些mRNA5′端非编码区存在一个或数个AUG，存在起始位点上游的其它AUG密码或5′AUG，它抑制下游阅读框的翻译效率。5′AUG阅读框与正常阅读框不一致，从5′AUG翻译很快遇到终止密码子。当前56页，总共67页。

如酵母反式因子GCN4mRNA，其5′-UTR有4个AUG，含4个短的阅读框，它们对正常阅读框的翻译有抑制作用。TGF-3mRNA5′-UTR含11个AUG

当前57页，总共67页。

3、mRNA5′端非编码区长度对翻译的影响

5′-UTR长度在17-80核苷酸之间，体外翻译效率与长度呈正比，若第一个AUG与5′帽结构之间的距离在12个核苷酸以内时，则有一半以上的核糖体小亚基滑过第一个AUG当前58页，总共67页。

4、阻遏蛋白的调控作用

控制mRNA的可翻译性。阻遏蛋白与mRNA5′端结合，阻止mRNA的翻译，如铁调节结合蛋白未与铁结合时，可与铁蛋白mRNA的茎环结构结合，而抑制其翻译。有铁时，该蛋白与铁结合，从铁蛋白mRNA茎环结构解离，铁蛋白的翻译效率提高100多倍。当前59页，总共67页。当前60页，总共67页。

5、翻译起始因子的功能调控⑴elF-4F因子的磷酸化对蛋白质合成速率的激活作用

4F由、、三个亚基组成，结合mRNA5′-m7G,40s小亚基，elF-2，GTP，Met-tRNA三元复合物才能与mRNA相连，进入翻译的起始阶段。

elF-4FPKCelF-4F-p

亚基磷酸化可促使4F的三个亚单位复合物形成，这类复合物是起始因子识别mRNA的活性形式，亚基磷酸化的意义有待研究。当前61页，总共67页。

⑵elF-2的磷酸化对翻译的抑制作用elF-2是蛋白质合成过程中重要的起始因子。其活性因磷酸化而降低。而磷酸化则由一种cAMP依赖性蛋白激酶所催化，由于血红素能抑制cAMP依赖性蛋白激酶的活化，从而防止或减少elF-2失活，促进蛋白质的合成。当前62页，总共67页。