微生物显微镜和显微技术课件

§2显微镜和显微技术当前1页，总共46页。3/13/20231当前2页，总共46页。3/13/20232借助于显微镜观察微生物的方法即显微技术，显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。当前3页，总共46页。3/13/20233显微镜的种类和原理显微观察样品的制备当前4页，总共46页。3/13/20234一、显微镜的种类和原理(一)、光学显微镜普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜现在的光学显微镜分辨的最小极限达0.2μm。当前5页，总共46页。3/13/20235普通光学显微镜的几个基本概念当前6页，总共46页。3/13/20236当前7页，总共46页。3/13/20237当前8页，总共46页。3/13/20238当前9页，总共46页。3/13/20239当前10页，总共46页。3/13/2023101、普通光学显微镜由三部分构成①照明系统：包括光源和聚光器；②光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置：用于固定材料和观察方便当前11页，总共46页。3/13/202311油镜使用光镜使用方法当前12页，总共46页。3/13/2023122、暗视野显微镜原理：聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。适用范围：生活细菌运动性观察。

当前13页，总共46页。3/13/202313特点:只能看到物体的存在与运动,不能辨清其微细结构。暗视野显微镜的使用当前14页，总共46页。3/13/202314基本原理:把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。3、相差显微镜相差显微镜使用当前15页，总共46页。3/13/202315微分干涉差显微镜DIC显微镜下的硅藻形态适用范围：对透明的活体进行直接观察当前16页，总共46页。3/13/2023164、荧光显微镜原理：荧光素吸收紫外线并放出部分波长较长的可见光，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体当前17页，总共46页。3/13/202317绿色：铜绿假单胞菌黄色：蜡样芽孢杆菌绿色：微管红色：微丝蓝色：核当前18页，总共46页。3/13/2023181931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。用高速电子束代替光束。放大倍数可达80万倍，分辨的最小极限达0.2纳米。

（二）电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜当前19页，总共46页。3/13/2023191、透射电子显微镜目前TEM的分辨力可达0.2nm。用电子束作光源，用电磁场作透镜。用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。放大倍数最高可达近百万倍.由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。当前20页，总共46页。3/13/202320高尔基体的TEM照片(伪彩色)当前21页，总共46页。3/13/202321当前22页，总共46页。3/13/2023222、扫描电子显微镜扫描电子显微镜大肠杆菌扫描电镜图工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。主要用于：样品表面结构当前23页，总共46页。3/13/202323扫描电子显微镜原理当前24页，总共46页。3/13/202324当前25页，总共46页。3/13/2023253、扫描隧道显微镜（STM）扫描隧道显微镜拍摄的7个铀原子团当前26页，总共46页。3/13/202326当前27页，总共46页。3/13/2023274原子力显微镜当前28页，总共46页。3/13/202328当前29页，总共46页。3/13/202329特点光学显微镜电子显微镜最高放大倍数约1000-150010万以上最佳分辨率0.2微米0.5纳米辐射源可见光电子束辐射源通过的媒介空气高真空透镜类型玻璃电磁体反差来源光吸收的差异或特定波长电子散射聚焦机械机械调节透镜位置调节电磁透镜的流向改变放大倍数的方法调换物镜或目镜调节电磁透镜的流向样品承载载玻片金属网（通常为铜网）光学显微镜和电子显微镜的特点比较当前30页，总共46页。3/13/202330（一）光学显微镜制样活体观察染色压滴法悬滴法菌丝埋片法活菌死菌美蓝染色简单染色鉴别染色革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色二、显微观察样品的制备当前31页，总共46页。3/13/202331（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖玻片，观察。（2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液，翻转置于特制的凹载玻片上，观察。（3）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养，取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。光学显微镜样品制备－－活体观察特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察

当前32页，总共46页。3/13/202332用途：微生物的细致形态和结构染色前需要对样品固定.常用固定方法：酒精火焰加热、化学固定光学显微样品制备－－染色观察当前33页，总共46页。3/13/2023331)、简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检2）、革兰氏染色法：涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察当前34页，总共46页。3/13/202334（二）、电子显微镜的制样样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，制样时一般采用重金属盐染色或喷镀，提高在电镜下的反差。当前35页，总共46页。3/13/202335※1、透射电镜的样品制备负染技术投影技术超薄切片技术冰冻蚀刻技术当前36页，总共46页。3/13/202336负染法将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染法。一般是采用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会进入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反映样品的内部结构。负染法原理当前37页，总共46页。3/13/202337负染色法观察的鞭毛用途：可以观察细菌细胞、病毒等。当前38页，总共46页。3/13/202338在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影了解样品的立体形状、高度。投影法当前39页，总共46页。3/13/202339投影法观察的噬菌体用途：观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒当前40页，总共46页。3/13/202340这是最常用的方法，可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。样品固定→脱水→包埋→切片。只有在20—100纳米厚度的切片用透射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到50片。超薄切片法超薄切片法观察的一种厌氧弧菌当前41页，总共46页。3/13/202341样品-196℃迅速冷冻→加温到-100℃→切割样品→升华(真空)掉断口处的冰→重金属喷镀断口表面→电子显微镜观察冰冻蚀刻法当前42页，总共46页。3/13/202342冰冻蚀刻法制备的酵母菌内部结构图优点:可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。当前43页，总共46页。3/13/202343

2、、扫描电镜样品的制备样品先要经过固定、脱水等处理，以