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RNA提取结果分析

2006.04.28100mg小鼠肝脏组织，液氮中研磨，组织碎末立即倒入3ml裂解液内。加入苯酚后离心，分三管收集上层水相，TE稀释40倍测OD。共收集1.5ml。异丙醇沉淀后，可以看见大量白色沉淀，三管合并，600ul裂解液溶解沉淀，TE稀释160倍测OD。此步共收集600ul。5ul裂解液对OD260有非常大的影响，RNA溶于水会导致OD260/280降低。产率不高的原因：1.研磨组织时有损失。2.两次异丙醇沉淀会有大量损失。3.乙醇洗涤时为避免长时间干燥，吸的很干。没有计算出回收率，改进办法：实验过程中测OD做控制时，使用5ul裂解液＋195ulTE调零。1％琼脂糖凝胶，旧的缓冲液。1.道：5ul1号管＋15ulDEP水。2.道：5ul1号管＋15ulDEP水，70℃孵育1h。3道：5ul1号管＋20ulDEP水，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电泳。4道：5ul1号管＋15ulDEP水＋5ulRNA酶，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电泳。5.道：5ul4号管＋15ulDEP水。6道：5ul1号管＋20ulDEP水，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电泳。7道：5ul1号管＋15ulDEP水＋5ulRNA酶，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电。电泳结果说明：1.RNA酶有作用，代表提出的是RNA。2.37℃孵育，氯仿抽提，振荡对电泳结果没有影响，但RNA有损失。RNA的消失是酶作用的，而与操作无关。3.第2道目的在于确认RNA溶液是否有残留的RNA酶。结果说明70℃孵育对结果有影响，RNA有降解。酶解后进行电泳证明确实提出了RNA，但是电泳条代还是不正常，RNA分子量偏小（在溴酚蓝附近）。两种可能，RNA在提取过程中断裂和出现降解。5ul提取的RNA，1％琼脂糖凝胶，新电泳缓冲液。与前几次的电泳结果一样，还是看不到28S、18S两条带。1.换了一种裂解液，但电泳结果还是很像，说明问题不出在裂解这一步。2.提取时间大大缩短，但电泳结果还是很像，说明长提取时间对结果没有影响。3.分析用到的有机溶剂，异丙醇和氯仿是在有裂解液的体系里沉淀RNA的，即使有RNA酶污染也不会降解RNA，异丙醇和氯仿污染可以被排除。剩下的就是乙醇了，两种方法里，加入乙醇操作的时间是相同的，如果乙醇有RNA酶污染，两种方法提取时RNA被裂解的效率是相同的，可以合理解释两次的电泳结果很类似。4.70℃保温实验的结果显示，RNA溶液中残留的RNA酶能把稍高分子量的RNA降解，以至于条代集中在胶

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