基因工程原理第3章基因克隆载体

基因工程原理PrincipleofGeneEngineering第三章基因工程原理当前1页，总共84页。DNA重组（限制性内切酶）运输工具——基因克隆载体目的基因的制备目的基因导入受体细胞外源基因的表达基因工程的应用当前2页，总共84页。第三章基因克隆载体克隆载体：一种具有特定功能的DNA分子，他们将携带外源DNA片段或基因进入受体细胞，并使其在特定受体细胞中得以维持或表达。原核生物克隆载体真核生物克隆载体穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制，又能在真核生物中复制的载体。当前3页，总共84页。针对受体细胞的可转移性自主复制功能：ori显著的筛选标记：抗药性或显色特定的多克隆位点：RE位点安全性：不含对受体有害基因、不任意转入其它细胞尤其是人体细胞第一节克隆载体的一般特征当前4页，总共84页。一、细菌质粒载体第二节原核生物基因克隆载体——细菌质粒载体是以细菌质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，主要用于外源基因片段的转移、贮存、表达以及基因文库的构建等。当前5页，总共84页。——宿主细胞染色体外裸露的双链DNA分子。（一）质粒（Plasmid）组成与构型1.质粒构型：共价闭合环型DNA（ccc-DNA）呈超螺旋SC构型开环DNA（oc-DNA）线性DNA（L-DNA）当前6页，总共84页。ccc-DNAl-DNAoc-DNA当前7页，总共84页。2.质粒DNA分子大小当前8页，总共84页。3.质粒的复制——严紧型质粒：1个寄主内仅含1-3拷贝——松弛型质粒：1个寄主内含10-60拷贝当前9页，总共84页。质粒DNA复制：单向复制，受宿主细胞和质粒遗传系统双重控制，不会无限制复制。质粒DNA复制控制机理的分子模型：自体阻遏蛋白质模型（autorepressormodel）抑制蛋白质稀释模型（inhibitordilutionmodel）质粒控制：Ori序列拷贝数：细胞内某种质粒的数量与染色体的数量之比。当前10页，总共84页。自体阻遏蛋白质模型：质粒DNA复制控制机理有两种解释解释一：质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质Rep引发的。Rep蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。自体阻遏蛋白质通过同启动子-操纵基因区（P/O）的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Atr和Rep蛋白质处于恒定的水平。而后，由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的结合，来引发质粒DNA的复制[图（a）]。当前11页，总共84页。自体阻遏蛋白质模型：解释二：Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质。它既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用；同时又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（ori）发生作用，引发质粒DNA进行复制[图（b）]当前12页，总共84页。抑制蛋白质稀释模型：质粒DNA的复制，是受一种由质粒DNA编码的抑制蛋白质Cop调控的。细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比。Cop抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两种途径：通过同质粒DNA的复制起点（ori）结合，直接地抑制质粒DNA的复制。通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。当前13页，总共84页。——在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象叫质粒不亲和性。随着细胞分裂质粒分配到子细胞质粒拷贝数加倍两种不相容质粒的拷贝数变化4.质粒的不亲和性当前14页，总共84页。野生型与其衍生物通常属于不亲和质粒，因此，受体细胞最好不含内源质粒当前15页，总共84页。接合型质粒：含有tra基因的质粒。F质粒非接合型质粒：不含tra基因的质粒。ColE15.质粒迁移——转移性质粒可在细胞间转移，并能带动染色体发生转移的现象。构建克隆载体的一般是非接合型质粒当前16页，总共84页。显性质粒：能使宿主细胞表现出质粒所携带的性状。如：隐蔽质粒：不会赋予宿主细胞新性状的质粒为隐性质粒。6.显性质粒和隐蔽质粒抗性质粒（R质粒），抗Amp（Ap)、抗Cmp（Cm)、抗Kan（Km)、抗Tet（Tc)等育性质粒（F质粒）降解质粒：降解农药Ti质粒：形成冠瘿瘤当前17页，总共84页。（二）构建质粒克隆载体的策略含有有效的质粒复制起始位点（ori）含有外源DNA片段克隆位点含有标记基因载体DNA分子尽可能小特殊需要的元件：强启动子、终止子…当前18页，总共84页。（三）质粒载体的构建选择合适的出发质粒：ori，选择标记、克隆位点、启动子、终止子……正确获得构建质粒载体的元件组装合适的选择标记基因选用合适的启动子构建过程简单1.质粒载体的构建原则当前19页，总共84页。pBR322质粒的结构特征：大小：4363bp具有ColE1拷贝复制子选择标记：Amp，Tet24种限制性核酸内切酶单一位点

BamHI等导致Tet插入失活

PstI等导致Amp插入失活可以克隆10kb以下外源DNA片段2.大肠杆菌质粒克隆载体pBR322当前20页，总共84页。启动子区当前21页，总共84页。启动子：Promotor，DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。当前22页，总共84页。Pribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列当前23页，总共84页。pBR322质粒克隆载体构建：当前24页，总共84页。pBR322质粒载体的结构来源优点：分子量小2个选择标记及若干个插入失活位点高拷贝数Apr缺点：负筛选当前25页，总共84页。①pUC质粒载体的结构特点pBR322的复制起点Amp标记大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因LacZ的启动子、调节因子及编码α-肽链的DNA序列——LacZ’在LacZ’的5‘端有1段多克隆位点（MCS）区段。3.质粒克隆载体pUC18/19当前26页，总共84页。当前27页，总共84页。当前28页，总共84页。pUC质粒载体的优点——具有更小的分子量和更高的拷贝数pUC18/19的分子量2.69kb——具有多克隆位点：多种粘性末端的切点——筛选方便：蓝/白菌落当前29页，总共84页。当前30页，总共84页。pBR322质粒是人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，分子大小为（4.3kb），具有松弛型复制子，选择标记为（Amp）和（Tet）。就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：（复制区：含有复制起点）；（选择标记：主要是抗性基因）；（克隆位点：便于外源DNA的插入）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。载体的功能是（d）（a）外源基因进入受体的搭载工具（b）不能为外源基因提供整合能力（c）不能提供复制能力（d）不能为外源基因提供表达能力基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有（a）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体（a）pSCl01（b）pBR322（c）pUBll0（d）pUCl8当前31页，总共84页。第七次课结束！当前32页，总共84页。4.TA载体TTAA当前33页，总共84页。当前34页，总共84页。5.质粒表达载体——表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。当前35页，总共84页。lac启动子表达系统当前36页，总共84页。质粒表达载体融合型表达载体非融合型表达载体分泌型表达载体当前37页，总共84页。融合蛋白质克隆载体克隆外源基因示意图融合蛋白表达载体：融合蛋白：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因转移产生的单一的多肽序列。当前38页，总共84页。表达融合体蛋白质策略的优点：（1）克隆的外源基因能有效转译。（2）表达的蛋白质稳定。（3）可以加入信号肽，定位输送蛋白质。（4）利于分离纯化。当前39页，总共84页。非融合蛋白表达载体：当前40页，总共84页。二、噬菌体克隆载体λDNA：——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环状DNA分子。——长48kb。——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。形成cos位点。——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。当前41页，总共84页。相关概念：溶菌生命周期：噬菌体吸附到寄主细胞表面后，注入DNA进行复制及蛋白质合成，并组装成子代噬菌体颗粒后，使寄主细胞破裂，释放出来的过程。溶原生命周期：在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体上，随着染色体的复制而复制的过程。温和噬菌体：能进入溶原周期和溶菌周期的噬菌体。烈性噬菌体：具有溶菌生命周期的噬菌体。溶原性细菌：带有温和噬菌体的细菌。当前42页，总共84页。溶原性噬菌体的生命周期a：噬菌体吸附到寄主细胞表面；b：噬菌体DNA注入寄主细胞；c：噬菌体大量增殖d：子代噬菌体颗粒组装；e：寄主细胞溶菌；f：噬菌体DNA从寄主染色体DNA上删除下来；g：溶原性细胞按照正常速率分裂。当前43页，总共84页。1.与构建载体相关的λ噬菌体性质基因按功能相近性聚集成簇：左侧区：A-J，合成头尾蛋白的全部基因中间区：J-N，非必要区，与重组有关右侧区：N-R，DNA合成及调控。当前44页，总共84页。G+C=10A+T=2cos位点：cohesive-endsite粘性末端位点线性双链DNA分子两端各有1条由12个核苷酸组成的完全互补的5'单链突出序列，即粘性末端。注入到寄主细胞内的线性DNA分子会迅速的通过粘性末端之间的互补作用，形成环状双链DNA分子。然后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5'—P和3'—OH基团封闭起来，进一步超盘旋化，这种由粘性末端结合形成的双链DNA区域称为cos位点。当前45页，总共84页。2.λ噬菌体作为构建克隆载体的依据λ噬菌体是一种温和噬菌体能承载比较大的外源DNA片段存在多个限制性位点当前46页，总共84页。3.构建λ噬菌体克隆载体的基本策略和路线用限制酶切去λDNA上的非必需区在λDNA的非必需区内组入选择性标构建重组λDNA分子体外包装系统当前47页，总共84页。噬菌体的包装：当前48页，总共84页。体外包装：在离体条件下，用噬菌体或病毒的蛋白质包裹噬菌体或病毒的裸核酸，组装成有感染性的噬菌体或病毒颗粒的过程。当前49页，总共84页。λDNA分子体外包装系统的建立E基因：λ噬菌体的E基因编码头部基因的主要成分（占头部总蛋白的70%）D基因：λ噬菌体的D基因也编码头部蛋白，但主要与λDNA进入头部和头部的成熟有关（占20%）当前50页，总共84页。当前51页，总共84页。当前52页，总共84页。4.λ噬菌体DNA的包装限制问题包装能力：λDNA×75%——λDNA×105%，即从36kb——51kb野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为51kb-28kb=23kb。实际为15kb。若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。当前53页，总共84页。转染作用（transfection）：寄主细胞捕获噬菌体DNA的过程。或重组噬菌体DNA分子感染并进入大肠杆菌的过程。转导作用（transduction）：以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的过程。转化作用（transformation）：将质粒等外源DNA引入细胞的过程。5.λ噬菌体克隆载体的应用——构建cDNA文库细菌质粒载体：是以细菌质粒DNA分子为基础构建的克隆载体，主要用于外源基因片段的转移、贮存、表达以及基因文库的构建等。当前54页，总共84页。三、Cosmid载体（cossite-carryingplasmid）（一）Cosmid载体的特征环形双链DNA分子，大小一般在10kb以下具有质粒的性质含有一个cos位点：cohesive-endsite粘性末端位点能承载较大的外源DNA片段——一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。当前55页，总共84页。

克隆能力：31—45kbpBR322（6524bp)λDNA：cos序列和控制包装序列pBR322质粒的复制子抗药性基因多克隆位点区当前56页，总共84页。（二）Cosmid载体的应用程序应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做柯斯克隆（cosmidcloning）。克隆进柯斯载体包装进噬菌体感染大肠杆菌选择转化子当前57页，总共84页。进行λDNA体外包装时，选择E基因突变的λ噬菌体，能够使溶菌物中积累了大量的（尾部蛋白），而利用D基因突变的λ噬菌体，产生大量的（头部蛋白），把这两种溶菌物和重组DNA混合起来，将重组λDNA包装起来。 重组在λ噬菌体载体上的DNA分子转导大肠杆菌的过程包括：制备包装物，然后进行（体外包装），侵染（大肠杆菌），并筛选（重组体）噬菌斑。柯斯质粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自（质粒）、COS位点序列来自（噬菌体），最大的克隆片段达到（45）kb。噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的（75％～105％）的范围内。下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大？（b）（a）质粒（b）cosmid（c）λ噬菌体载体（d）cDNA表达载体（e）pUC质粒当前58页，总共84页。第八次课结束！当前59页，总共84页。四、蓝藻基因克隆载体（一）蓝藻质粒表达载体pPEK2的构建出发质粒：蓝藻pPbS和pBR322当前60页，总共84页。（二）蓝藻染色体定位整合载体的构建当前61页，总共84页。第三节酵母基因克隆载体1.2μm质粒当前62页，总共84页。当前63页，总共84页。2.YEp24（酵母游离型质粒）载体出发质粒：酵母2mm质粒和pBR322当前64页，总共84页。ura3基因：尿嘧啶合成缺陷型基因酵母V号染色体上的一个基因，系统命名号为YEL021W，编码乳清苷5-磷酸脱羧酶，是酵母RNA嘧啶核苷酸合成过程中关键酶。应用方式：（2）阴性选择：乳清苷5-磷酸脱羧酶正常（1）阳性选择：乳清苷5-磷酸脱羧酶缺陷转入ura3基因，培养基中加入尿苷或尿嘧啶，缺陷株生长。5-氟乳清酸5-氟尿嘧啶，乳清苷5-磷酸脱羧酶细胞死亡当前65页，总共84页。Ti质粒（Tumorinducingplasmid）——存在于植物的土壤致癌农杆菌中，诱发植物产生冠瘿瘤的质粒。分为4种类型：一、农杆菌Ti质粒载体章鱼碱型胭脂碱型琥珀碱型农杆碱型第四节植物基因克隆载体（一）农杆菌Ti质粒当前66页，总共84页。Ti质粒是根癌农杆菌染色体以外的遗传物质双链闭合环型DNA200-250kb结构分为4个功能区：

（Vir区）（Con区）T-DNA区Vir区Con区Ori区当前67页，总共84页。（Vir区）（Con区）长度25kb，占Ti质粒1/10主要功能是转移DNA，随机插入植物染色体中。——天然的质粒克隆载体。含有2类基因：（1）编码冠瘿碱合成酶（ocs、nos）及分解代谢的基因。（2）诱发肿瘤基因（Onc）Vir区：激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性。占Ti质粒1/3。Con区——调控Ti质粒在农杆菌之间的转移，含有与细菌间接合转移的有关基因tra。Ori区——复制起始区。当前68页，总共84页。（二）农杆菌Ti质粒克隆载体的构建取代型Ti质粒载体的构建当前69页，总共84页。第五节动物基因克隆载体一、SV40克隆载体二、逆转录病毒基因载体三、腺病毒基因载体四、豆苗病毒基因载体五、杆状病毒表达载体当前70页，总共84页。SV40克隆载体：猿猴空泡病毒405243bp当前71页，总共84页。一、酵母人工染色体（YAC）的构建第六节人工染色体载体利用酵母着丝粒载体所构建的大片段DNA克隆。克隆载体上含有着丝粒、端粒、可选择标志基因、自主复制等序列，可携带插入的大片段DNA(100～1000kb)在酵母细胞中有效地复制，如同微小的人工染色体。是基因组研究的有用工具。当前72页，总共84页。TEL：酵母染色体DNA端粒ARS：DNA复制起点CEN：着丝粒应用：构建人类和高等生物的基因组文库选择标记his3：组氨酸合成缺陷型基因Trp1：色氨酸合成缺陷型基因ura3：尿嘧啶合成缺陷型基因sup4：赭石突变抑制基因第二受体克隆子筛选标记第一受体克隆子筛选标记：抗生素当前73页，总共84页。某一突变基因的表型效应由于第二个突变基因的出现而恢复正常时,称后一突变基因为前者的抑制基因。回复突变使突变基因的脱氧核糖核酸(DNA)分子结构恢复正常；抑制基因则并不改变突变基因的DNA分子结构,而只是使突变型的表型恢复正常。抑制基因一般用符号Su代表。无义抑制基因的种类：琥珀型抑制基因：UAG赭石型抑制基因：UAA乳白型抑制基因：UGA、UAG当前74页，总共84页。酵母人工染色体（YAC）的应用酵母人工染色体（YAC）的局限性构建基因组文库存在插入子的稳定性问题。同一酵母细胞内多个YAC引起交换转化效率低。难以制备纯的YAC-DNA（因结合组蛋白）。当前75页，总共84页。二、细菌人工染色体载体（BAC）利用大肠杆菌F质粒或P1噬菌体为基础构建的用于在大肠杆菌中克隆大片段DNA(100～350kb)的载体。用于基因组结构的分析。当前76页，总共84页。特点：

带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的；

载体分子量很小(7.4kb)；

选择标记：氯霉素抗性基因；

多克隆位点。当前77页，总共84页。BAC的优点：BAC的优点：1.BAC复制子来源于F因子：稳定性好2.宿主为大肠杆菌3.体外操作简单4.容易构建5.筛选方便6.克隆位点两侧含有T7和Sp6聚合酶启动子，可用于转录获得RNA探针获直接