动保中心鸡血凝血抑实验

动保中心鸡血凝血抑实验第一页，共二十四页，2022年，8月28日主要内容：一、实验原理二、实验材料五、实验方法与结果判定六、举例说明七、注意事项第二页，共二十四页，2022年，8月28日化验室是生产技术部一部分，和生产密切相关。

我们主要负责各养殖场场鸡群的抗体检测工作。主要抗体检测：血凝抑制试验抗体是鸡群接触抗原（包括疫苗和有害病原微生物）体内产生的特异性蛋白质。他能很好反映机体的感染或抵抗状况第三页，共二十四页，2022年，8月28日1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。病毒颗粒红细胞第四页，共二十四页，2022年，8月28日2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。抗体抗原第五页，共二十四页，2022年，8月28日

3、抗原：凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体结合而发生特异反应的物质称为抗原。4、抗体：是机体受到抗原物质刺激产生的具有特异性的免疫球蛋白，它能与相应的抗原结合，发生特异性反应，并具有一定的消除病原微生物及其产物的物质。适用范围：适用于对鸡新城疫(ND)，禽流感(H9、H5-4、H5-5)抗体滴度的检测。第六页，共二十四页，2022年，8月28日材料准备离心机（离心红细胞和离心血清）冰箱（存放抗原和血清）振荡器（振荡96孔V型板）抗原：新城疫（ND）、流感（H9、H5-4、H5-5）抗原（从指定厂家买稳定的浓缩抗原）1%红细胞悬液、PBS液（做血清稀释液用、配制4单位抗原）离心管和离心盒（保存血清）96孔V型板(稀释血清)

单道、八道移液器、十二道移液器和枪头（加样、稀释血清）积液巢（盛PBS液及配制4单位抗原）第七页，共二十四页，2022年，8月28日附录1PBS液配制准确称取NaCl24g、Na2HPO48.7g、KCl0.6g、KH2PO40.6g，加蒸馏水至3000mL，加热溶解后调pH值至7.2，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。附录21%鸡红细胞悬液制备采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积PBS液混合，将混合液10ml装入带刻度离心管，配平后放入离心机中，经2000r/min，离心4min。用吸管吸去上清液与白细胞、弃去，将沉淀的红细胞加生理盐水洗涤，如此反复离心三次，第四次离心时2500r/min，离心5min，将最后一次离心后的红细胞泥，按1%的稀释度加入PBS液中稀释，4℃保存备用。第八页，共二十四页，2022年，8月28日血凝（HA）试验采用96孔V型反应板，测定抗原效价1、首先用微量移液器向反应板的每孔加PBS液30微升。2、用微量移液器吸取待测抗原30微升于第一孔中并挤压6-7次混合，之后吸出30微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔、弃去30微升。12孔为红细胞对照孔。每种抗原4个平行对照。3、用微量移液器再向反应板的每孔加PBS液30微升。4、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔30微升。5、置于微量振荡器上振荡10--30秒。6、室温静置40分钟后观察结果。第九页，共二十四页，2022年，8月28日1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×红细胞对照PBS液303030303030303030303030抗原3030303030303030303030弃去30红细胞303030303030303030303030结果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－操作示意图第十页，共二十四页，2022年，8月28日结果观察：

将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞平铺孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩1所示第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。

血凝实验主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制实验所用病毒的稀释倍数（抗原单位）第十一页，共二十四页，2022年，8月28日第十二页，共二十四页，2022年，8月28日4单位抗原校正1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。例：上图1抗原效价为1：256，HI试验时，30微升抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升PBS液。2、首先用微量移液器向反应板的第1孔至第5孔加生理盐水30微升。3、用微量移液器吸取4单位抗原30微升分别加入第1孔中，从第1孔开始挤压6-7次混合，后吸出30微升至第2孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去30微升。4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-5孔，每孔30微升。5、于微量振荡器上振荡10~30秒。6、室温静置40分钟后观察结果。7、结果观察：第1、2孔为完全凝集，第3孔红细胞为50%沉淀，第4孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。如图2所示。第十三页，共二十四页，2022年，8月28日第十四页，共二十四页，2022年，8月28日血凝抑制（HI）试验每排每孔检测1份血清。步骤如下：1.用微量移液器先加30微升PBS液于各孔中。2.用微量移液器吸取待检血清30微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去30微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔30微升（1-12）。4.置于微量振荡器上振荡10-30秒，混合均匀。5.室温静置30分钟。6.用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加30微升。7.置于微量振荡器上振荡10-30秒，混合均匀。8.室温静置40分钟后观察结果。第十五页，共二十四页，2022年，8月28日结果判定：1）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。见图3：图3上图抗体结果从上至下依次为：8/7/8/9/8/7/7/6第十六页，共二十四页，2022年，8月28日2）判定标准：1.ND抗体：育雏育成鸡在6以上，产蛋鸡在8以上。2.H5体：抗体值在6以上。3.H9抗抗体：抗体值在7以上。能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价注：在实际生产中，则以实际免疫程序进行分析抗体滴度值的高低。第十七页，共二十四页，2022年，8月28日

免疫后抗体规律

一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持1-2个月。灭活疫苗免后10-15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月

对H5抗体要求6—11，低于5时及时免疫

H9抗体在7--11，当最低抗体为6时及时免疫H9单苗

ND抗体在7--12产蛋鸡最低值7补苗

第十八页，共二十四页，2022年，8月28日实验后处理：96孔V型反应板的清洗：

自来水冲洗、甩干泡酸自来水冲洗、甩干纯净水冲洗甩干两次60℃烤干抗原空瓶：高压灭菌回收利用或弃去读取抗体值：

记录汇总存档第十九页，共二十四页，2022年，8月28日实验室抗体检测对实际生产的重要性母源抗体能反映一个鸡场的种源种鸡的健康程度，如果种源出现问题，这批鸡肯定不好养。母源抗体加上2-3个滴度就是种鸡群的抗体结果：所以母源抗体个体值ND、H9达到2log12，H5达到2log10是不正常的。从母源抗体推测出，种鸡抗体肯定有2log14个体，说明种鸡感染H9第二十页，共二十四页，2022年，8月28日种鸡群发生过新城疫，雏鸡抗体表现有12的。第二十一页，共二十四页，2022