酶工程期末复习2015春chapter8分子的定向进化

Chapter8酶分子的定向进化天然酶的局限酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求。天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。稳定性差催化效率低缺乏商业价值现代生物工程对酶的要求具备长期稳定性和活性可利用不同底物（自然界不存在的合成底物）

适用于水及非水相环境能在特殊环境中合成和拆分制作药物的原材料酶分子定向进化（酶定向进化）:

模拟自然进化过程（随机变异和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。

[实质]：

“突变＋筛选/选择”的重复循环，且整个进化过程完全是在人为控制下进行的。分子定向进化以各种生物大分子为进化对象，目的是改良目标分子的结构、功能和特性。1993年，美国科学家ArnoldFH首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。酶定向进化的基本过程酶基因随机突变构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶反复进行易错PCRDNA重排基因家族重排平板筛选荧光筛选噬菌体表面展示细胞表面展示核糖体表面展示高通量筛选第一节

酶基因体外随机突变一、易错PCR技术易错PCR技术是从酶的单一基因出发，在改变反应条件下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。

易错PCR反应条件①Mg2+浓度较高，以稳定非互补的碱基对。

普通PCRMg2+浓度0.5-2.5mmol/L。②添加Mn2+

，以降低聚合酶对模版的特异性。③4种底物的浓度比改变，采用浓度不平衡的各种底物，使碱基配对错误出现频率增加。遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性进化。易错PCR操作注意事项控制好适当的突变频率频率太低，难于筛选到理想的正突变体频率太高，增加筛选工作量一般一个目的基因的错配碱基数目控在2-5个通常采用连续易错PCR：将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变。易错PCR特点操作简便，随机突变丰富正突变概率低，筛选工作量大适合较小基因（＜800bp）的定向进化二、DNA重排技术DNA重排技术（DNA改组技术）从两种以上的同源正突变基因出发，用酶切成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。又称为有性PCR，将亲本基因群中的突变尽可能组合在一起，以导致更大的变异，最终获得具有最佳突变组合。1994年由Stemmer等人首次提出，使用该技术使β-内酰胺酶定向进化，催化效率提高32,000倍。DNA重组装原理图DNaseI产生随机片段；随机片段变性；随机片段复性；延伸重复2-4步，获得全长DNA片段操作过程(1)靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲本基因群，用DNaseI随机切割；(2)得到的片段经过不加引物的多次PCR循环，片段之间互为引物和模板进行扩增，直至获得全长基因；(3)再加入基因的两端引物进行常规PCR，最终获得发生改组的基因库。DNA重排技术特点正突变体概率高，进化速度较快；在获得全长基因之前要除去DNaseI。DNA重排技术的改进交错延伸PCR技术随机引物体外重组技术1、交错延伸PCR技术在PCR反应中,将含不同点突变的模板混合（≥2DNA片段）将常规的退火和延伸合并为一步，大大缩短其反应时间（55℃，5s）经变性的新生链再作为引物，随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，此过程反复进行直至获得全长基因。结果会产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。只能合成非常短的新生链2、随机引物体外重组技术采用单链DNA为模板，配合若干条随机序列引物进行PCR反应；随机引物PCR互为模板和引物产生大量互补于模板不同位点的DNA小片段；然后除去模板；这些DNA小片段互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因。

随机引物体外重组技术的优点:

（与常规DNA改组相比）以单链DNA为模板，可直接用mRNA或cDNA为亲本。随机片段不是由亲本基因切割获得，大大降低亲本DNA的制备量。省去DnaseI切割过程，更为简单。随机引物长度相同，无序列倾向性。理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变。随机引发合成的DNA片段大小不受DNA模板长度的限制。三、基因家族重排(改组)技术从基因家族的若干同源基因出发，用酶(DNaseI)切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR扩增，使DNA碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA重排与基因家族重排的比较基本过程大致相同出发基因不同以单一的酶分子基因进行定向进化；

基因的多样化起源于易错PCR等反应中产生的随机突变；

所以采用这种过程累积有益突变的速度比较慢。从自然界中存在的基因家族出发，利用其同源序列进行DNA改组；由于每一个天然酶的基因都经过千百万年的进化,并且基因之间存在比较显著的差异，所以所得重组基因库充分体现了基因的多样化；排除不必要的突变，大大加速了基因的体外进化速度。DNA重排基因家族重排单链化限制性内切酶消化DnaseI消化无外源引物PCR重组基因库片段化同源基因常规PCR基因家族改组方法1)常规方法（DNAaseI消化）2)单链DNA介导3)限制性内切酶介导3种方法获得的突变基因多样性比较1007550250123产生的杂合基因百分比1)常规方法2)单链DNA介导3)限制性内切酶介导第二节

酶基因突变的定向选择一、突变基因文库的构建将各种不同的突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。是筛选获得目的突变基因的重要步骤。酶基因突变的定向选择在人工控制条件的特殊环境下，按设定的进化方向对突变基因进行选择，以获得具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。（一）构建基因文库的质量要求必须尽可能地把各种突变基因包含在其中(包容性)，并且能够完整地反映基因的结构和功能信息(完整性)。包容性：所构建的文库必须尽可能地包含基因的任何一种可能的突变信息，包括正突变、负突变、和中性突变，以便进行全面筛选。（库容量≥106）。完整性：文库中包含的DNA片段必须尽可能完整地反映基因的结构和功能信息，以便通过筛选得到的突变基因能够通过表达获得完整的具有催化功能的进化酶。（二）构建突变基因文库的过程载体的选择、基因重组、形成基因文库等。1.载体的选择突变基因文库的构建，要通过DNA连接酶的作用，将突变基因与适当的载体（vector）重组，所以首先要根据目的基因的特性、载体的特点和重组DNA的筛选方法等选择适宜的载体。（1）质粒载体质粒载体特点有自主的复制起点两种以上的易于检测的选择性标记多种限制性内切核酸酶的单一酶切位点适合小片段DNA的重组适于构建原核生物基因文库、cDNA库和次级克隆。黏粒(cosmid)：一类人工构建的含有λDNA黏端和质粒复制子的质粒载体，又称柯斯质粒。黏粒载体包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA的cos位点。常被用来构建高等生物基因文库（3）黏粒载体（2）噬菌体DNA载体由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载体。最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。噬菌粒(hagemid)：一类人工构建的由M13单链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。（4）噬菌粒载体含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；载体足够小，可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。特点：2.基因重组在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体DNA连接在一起形成重组DNA的技术过程。黏性末端连接、平头末端连接、修饰末端连接等。(1)黏端连接将载体DNA和目的基因用形成黏性末端的同一种限制性内切核酸酶进行切割，形成黏性末端；按照1：1的比例混合，经过退火处理，使载体DNA与外源DNA的黏性末端结合，形成双链结合体；在T4DNA连接酶的作用下双链结合体连接形成稳定重组DNA分子。有些限制性内切酶（HPaI，SmaI等）作用于DNA分子后，形成的末端是平端。(2)平端连接具有平端的质粒载体DNA和外源DNA分子，可以在T4DNA连接酶的作用下，形成重组DNA分子。重组效率比黏端连接低很多提高外源DNA和质粒DNA浓度提高T4DNA连接酶浓度降低ATP浓度避免亚精胺等多胺物质的存在(3)修饰末端连接当载体DNA和外源DNA的末端不匹配时，T4DNA连接酶无法进行连接。连接之前，必须对其中1个或2个末端进行修饰处理，使两种DNA末端互相匹配DNA。主要修饰方法：引进附加末端：附加末端一般为单链DNA，也可是双链DNA；可在一个末端附加，也可以在两个末端都附加。一端加接头两端加接头35/138同聚加尾法分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。非酶切位点DNA接头(adapter)连接法Adapter：

一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。Blunt-endedDNAP--P5‘p-GATCCCGG-

GGCC--CCGG-GGCCCTAG-p5’

BamHIadapter5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’

CCGGGATCCCGG-OH

GGCCCTAGGGCC-P5’

接头自我连接3.组装突变基因文库突变文库的组装是将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的重组噬菌体的过程。重组质粒载体：

通过细胞转化等方法将重组DNA转入受体细胞，形成突变基因文库。重组噬菌体DNA载体：

用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，成为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。大肠杆菌转化（transformation)E.coli感受态细胞感受态制备0℃，0.1MCaCl2加入质粒42℃热激90s，立即冰浴培养扩增抗性筛选LB-抗生素二、突变基因的筛选根据定向进化的目的，在一定环境条件下进行筛选，从突变基因文库中选取得到所需的突变基因。（一）定向选择环境条件的设定根据定向进化的设定选择环境在每一次“突变——筛选”的循环中加以调整选择环境提高酶的热稳定性：较高温度下培养重组细胞，每次循环提高温度。提高β-内酰胺酶的催化效率：

一定浓度的β-内酰胺类抗生素中培养，每次提高浓度。（二）高通量筛选技术技术要求：通量大、效率高，在较短时间内简便的判断出正突变基因，并易于排除无效突变基因。常用高通量筛选方法平板筛选法荧光筛选法噬菌体表面展示法细胞表面展示法核糖体表面展示法1、平板筛选法将含有随机突变基因的重组细胞，涂布在平板培养基上，在一定条件下培养，依据重组菌细胞的表型等差异鉴定出有效