基因的克隆方法大全

基因的克隆方法大全第1页/共42页2基因的表达过程mRNA翻译成蛋白质基因组DNA第2页/共42页3如何获得基因？——即基因的克隆方法

基于基因产物的基因克隆方法基于基因加标签的基因克隆方法基于基因序列的基因克隆方法基于基因图谱的基因克隆方法第3页/共42页4一、基于基因产物的基因克隆方法mRNA翻译成蛋白质1、根据蛋白质序列克隆目的基因2、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因第4页/共42页5

原理：根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后设计探针或引物从基因组文库或cDNA文库中分离出相应的基因。1、蛋白质序列克隆法第5页/共42页6实用性：分离纯化蛋白质十分困难CysMetAspGluMetLysArgAsnIleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA

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GATG

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G

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C据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列注意！密码子有简并性现象！第6页/共42页72、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因基因表达的差异表现：一是基因表达的种类的不同；二是基因表达水平的改变。第7页/共42页8差减杂交（SH）抑制性差减杂交（SSH）差异显示PCR（DDRT-PCR）DNA代表性差异分析（DNARDA）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）cDNA微阵列已发展的相应基因克隆方法：第8页/共42页9

差减杂交（SH）最早由Lamar和Palmer于1984年提出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究。超声波打断雌鼠的DNA（过量100倍）(XX)MboI完全消化雄鼠的DNA

(XY)变性、复性去除共有序列BamHI酶切表达载体连接、转化、测序分析缺点：技术要求高，耗时，工作量大NO.1NO.2NO.3第9页/共42页10SH在mRNA研究上的应用机理：

!!不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的cDNA量有限。特异表达基因的样本（TS）无特异表达基因的样本（RS）提取mRNA提取mRNAcDNAcDNA转录转录过量杂交TS的CDNA纯化、富集、扩增去除过量的RS的cDNA及杂交分子第10页/共42页11

基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；

基因时空表达的研究：如根、茎、叶；

不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。差减杂交技术的应用方面：第11页/共42页121.2.2抑制性差减杂交（SSH）Tester样本mRNADriver样本mRNASfiIAcDNAcDNASfiIBAB混合，变性杂交过量ABPCR扩增5`3`第12页/共42页13应用基因突变体的研究：如基因的表达与不表达基因时空表达的研究：如根、茎、叶不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照第13页/共42页141.2.3差异显示PCR（DDRT-PCR）最先由Liang等于1992年报道，目前已广泛在实验室使用。主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。5`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA第14页/共42页155`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT第15页/共42页16第16页/共42页17具体操作：1、提取mRNA；2、特定引物（12分之一）反转录；3、特定引物和RP结合RT-PCR；4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较DNA带，从而找出差别DNA。第17页/共42页18缺点：假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。无法定量研究。扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。第18页/共42页19

优点：简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。所需的mRNA量少。各样本mRNA的差异可同时进行比较。扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。第19页/共42页20二、基于基因加标签的基因克隆方法原理：主要是在生物基因组中插入外源的一段DNA，使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知的DNA片段来克隆基因的方法。第20页/共42页21外源DNA基因组染色体DNA基因A产生突变型分类：

T-DNA标签法转座子标签法。第21页/共42页22T-DNA标签法克隆基因技术路线：农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。第22页/共42页23野生株转基因株目的基因染色体T-DNA染色体T-DNA探针筛选转基因文库作探针筛选野生株基因文库构建基因组文库基因苗构建基因组文库基因苗阳性克隆目的基因获得阳性克隆基因序列分析，确定为基因阳性克隆转化突变体，确定基因功能第23页/共42页24转座子标签法转座子又称转座因子或者跳跃因子，实际上也是DNA片段，它可以在生物的染色体组中移动，从染色体的一个位点跳到另一个位点，或从一条染色体跳到另一条染色体上，引起基因功能的改变。第24页/共42页25转座子标签法最早是美国玉米育种家1951年发现，起初不被认同，1967年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实后得到认同。根据DNA的结构和转座的机理，分为两大家族：转座子和逆转座子，前者如玉米的Ac/Ds系统和spm因子，后者如果蝇的copia因子。第25页/共42页26转座子根据结构不同可以分为简单转座子和复杂转座子简单转座子：可以直接插入到其他位置,也叫插入序列。复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记。结构共同点：两端含有20-40个核苷酸的倒置重复序列。含有可编码转座酶的基因。应用：以Ac/Ds系统为例第26页/共42页27Ac/Ds系统操作原理把Ac，Ds分别转化并获得转化体。把Ac转化体同Ds转化体进行杂交得到F1代，然后自交得到F2、F3代分离群体，找出稳定突变个体。用Ds做probe筛选突变体文库获得突变基因的部分序列。用上述序列筛选正常个体基因组文库或cDNA文库，得到目的基因。第27页/共42页28三、基于基因序列的基因克隆方法

根据克隆的策略的不同，基于基因序列的基因克隆方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆法和通过PCR扩增基因法第28页/共42页291、通过分子杂交克隆法原理：根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分离获得的基因用于制作分子探针，从另一种生物的基因文库中分离出此生物中的同源基因。第29页/共42页301）直接从基因组中扩增过程：（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增及产物鉴定2、通过PCR扩增基因法原理：

根据基因序列结构特征，设计基因特异引物，利用PCR技术直接从生物的基因组或是cDNA中扩增出目的基因。第30页/共42页31提取基因组DNAPCR引物设计真核生物基因组含有内含子！此法适合扩增原核生物基因。PCR扩增基因序列分析第31页/共42页32（1）提取基因组

totalRNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增及序列分析（3）根据目的基因序列设计引物2）从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。第32页/共42页334、基于基因图谱的基因克隆方法又称图位克隆法，是建立在拥有RFLP等分子标记的连锁遗传图和基因文库，基因产物未知的一种基因克隆技术，理论上可以分离任何一个突变基因。第33页/共42页34染色体分子标记A分子标记B目的基因阳性克隆转化互补实验基因图位克隆示意图第34页/共42页35图位克隆基因的一般操作过程：通过遗传分析构建与目标基因紧密连锁的分子标记连锁图，达到基因的精细定位。用与目标基因紧密连锁的两侧分子标记筛选基因组文库，构建包含目标基因的基因组物理图谱。目的基因标记1标记2标记3标记4标记5第35页/共42页36染色体分子标记2分子标记3目的基因基因组物理图谱进一步精细定位获得目的基因第36页/共42页37通过染色体步移或染色体登陆技术对目标基因进行进一步精细定位，得到阳性克隆。对阳性克隆转化隐性受体进行功能互补。基因序列测定及表达分析等。第37页/共42页38影响基因图位克隆的因素：建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的距离大小。基因组的大小及可能存在的大量的重复序列。基因组文库的大小及单克隆的大小。成功的例子：水稻Xa21拟南芥的RPM1，RPS2等。第38页/共42页