基因工程原理章在酿酒酵母和其他真菌中的克隆

基因工程原理章在酿酒酵母和其他真菌中的克隆第1页/共37页真菌克隆的优势原核生物缺乏许多真核细胞所共有的功能，而真菌细胞具有。真菌细胞往往比植物和动物细胞更容易生长、操作。真菌细胞生物化学与高等真核生物非常相似，存在很多高等真核生物的同源基因。2第2页/共37页3酵母的优势酿酒酵母是理想的基因操作的真核生物：

1)细胞结构,e.g.nuclei,mitochodria,associationofDNAwithhistones.2)蛋白修饰,e.g.glycolization,phosphorylation.3)核不均一RNA（hnRNA）第3页/共37页把DNA导入真菌转化Cellsarefirstlytreatedwithenzymestopreparespheroplasts（原生质球）.ThentheforeignDNAisintroducedintospheroplastswithehtyleneglycol（乙二醇）inthepresenceofCaCl2orbyelectroporation.2.接合

Someenterobacterial（肠细菌）plasmidscanfacilitatetheplasmidtransferfromE.colitoS.cerevisiae.4第4页/共37页导入真菌的DNA的命运5ThreeformsoftransformedDNA.Homologousreplacement同源替换,Homologousinsertion同源插入,Randominsertion随机插入第5页/共37页6第6页/共37页应用于真菌的质粒载体yeastepisomalplasmid(酵母附加质粒,YEps)yeastreplicatingplasmids(酵母复制质粒,YRps)yeastcentromereplasmids(酵母着丝粒质粒,YCps)yeastartificialchromosomes(酵母人工染色体YAC)7第7页/共37页它们具共同的特性对于许多限制性内切酶，它们都含有唯一的作用位点。都可以在大肠杆菌中进行复制，且通常具有高拷贝数。都具有在酵母中容易进行选择的标记，且这些标记也可以在大肠杆菌中弥补相应的突变。e.g.His3,Leu2,Trp1,andLys28第8页/共37页9酵母附加型质粒第9页/共37页酵母复制型质粒自复制序列(ars)：可以使大肠杆菌载体在酵母细胞中进行复制的序列染色体DNA片段自复制序列与着丝点区别：前者作为复制起始位点发挥作用，而后者参与染色体的分离。10第10页/共37页酵母着丝粒质粒在结构上，质粒携带的着丝粒序列具有与酵母染色体着丝粒区域相同的特有结构。在功能上，YCp表现出酵母染色体的3个特征：1.在没有选择压力的情况下，它们在有丝分裂中具有稳定性。2.它们在减数分裂少按照孟德尔定律分离。3.它们在宿主细胞以低拷贝数存在。11第11页/共37页酵母人工染色体酵母染色体的末端都具有称为端粒(telo－mere)的特殊结构，这些末端在常规的DNA复制机制少往往无法完成复制。把酵母端粒克隆到YRp上，构建出第—个可保持为线性分子的载体，从而模拟了染色体。这样的载体称为酵母人工染色体(YAp).12第12页/共37页13构建包含大片段克隆DNA的酵母人工染色体第13页/共37页类似反转录病毒的载体1.Ty(酵母转座子):可移动遗传因子,30-40copies/genome,5.9kb.1)Structure:Centralregion---2ORFTerminalregion---334bprepeatscalleddelta2)delta:eachcontainsapromoterandsequencesfortransposingenzyme3)ORF1andORF2ORF1:homologoustotnpAwhichactsasatrans-actingfactorORF2:reverse-transcriptase14第14页/共37页Fig9.415第15页/共37页2.OverexpressionofORF1caninducevirus–likeparticles(VLPs)formationinyeastcells.16第16页/共37页17第17页/共37页克隆载体的选择把基因克隆到酵母中有3个理由：1.酵母是很有希望的克隆宿主，可以用来对有商业价值的蛋白进行过量生产。2.是可以克隆大片段DNA。3.YAC为克隆大片断DNA提供了方便的途径。18第18页/共37页19第19页/共37页20第20页/共37页在酵母中利用同源重组构建质粒1.UsuallyarecombinantmolecularcanbeobtainedbyligationoftwoDNAinvitro.2.

Thiscanbeachievedbyrecombinationinvivo,e.g.ToinserttheHis3frompBR328intoYep420.21第21页/共37页22第22页/共37页克隆基因的表达1.Typicalyeastpromoters’properties1)Initiator:TC(G/A)A,PuPuPyPuPu2)TATAbox3)Upstreamactivatingsequences(UASs)4)Upstreamrepressingsequences(URSs)23第23页/共37页24第24页/共37页2.Expressionofclonedcanalsobeaffectedbydownstreamactivatingsequences(DASs).

Phosphoglyceratekinase(磷酸甘油酸激酶，PGK)promotercanmakeheterologousproteinsaccumulateto1-2%oftotalcellprotein,whereasphosphoglyceratekinaseitselfaccumulatestoover50%..WhenDASsisaddedtodownstreamofPGKsequence,theexpressionlevelisrestored.25第25页/共37页蛋白在真菌中的过量表达1.Promoters:regulatede.g.GAL1Promoter:inducedbygalactoseinhibitedbyglucoseandactivatedbyGAL4protein.2.Hostcellse.g.巴斯德毕赤酵母

1)Astrongpromoter:AOX12)Integrateatspecificsites

3)

thestrainscanbecultivatedtohighdensity.26第26页/共37页27酵母中与半乳糖代谢相关的基因和酶第27页/共37页28酵母中半乳糖基因转录调控第28页/共37页专用载体29用于酵母的特殊载体第29页/共37页30用于巴斯德毕赤酵母的特殊载体第30页/共37页YeastsurfacedisplayPrinciple:Thereexistsasurfacereceptorα-agglutinin(凝集素，Aga),whichisaglycoproteinconsistedoftwosubunitscalledAga1andAga2.Aga1iscovalentlyligatedtocellwallandbindstoAga2bytwo–S-S-.IfatargetproteinisfusedwiththeC-terminalofAga2,thentherecombinantproteinwillbedisplayedonthesurfaceofyeastcells.31第31页/共37页32第32页/共37页检测蛋白—蛋白间的相互作用Principle:GAL4proteinhastwoseparatedomainsforbindingtoUASDNAandtranscriptionalactivation.TheDNAbindingdomain(DBD)isfusedtoatestprotein(bait诱饵),whiletheactivationdomain(prey猎物)isfusedwithaproteinencodedbylibraryplasmids.Ifthetestproteincaninteractwiththeproteinfromlibrary,thebaitandthepreybindtogether,andactivatethetranscriptionofareportgenesuchasLacZ.33第33页/共37页酵母双杂交系统Fig9.1134第34页/共37页Fig