基因工程的主要技术原理

基因工程的主要技术原理第1页/共53页1、Southernblot双链DNA限制性内切酶消化电泳分离检测放射自显影转膜NaOH变性洗膜杂交标记的探针NaOH或高温变性原理和方法:五.分子杂交技术第2页/共53页应用:

基因拷贝数检测;基因文库筛选,获取目的基因;遗传疾病诊断;转基因样品检测,等…第3页/共53页2、Northernblot是相对于Southernblot而命名的。利用DNA-RNA链或RNA-RNA链杂交的原理，通过DNA（或RNA）探针检测RNA样品。原理和方法:第4页/共53页单链RNA变性胶电泳分离检测放射自显影转膜洗膜杂交标记的探针NaOH或高温变性第5页/共53页应用:主要用于基因在转录水平上的表达研究。基因时空特异性表达，及表达模式分析；候选基因表达分析，有利于排除候选基因，等…第6页/共53页第7页/共53页Pi36-1Pi36-2RiceGAAS预测CRG2(2)CRG3(0)CRG4(0)5.8kb4.8kb6.4kbabc物理图谱NBS-LRRNBS-LRRRM5647(5)第8页/共53页Northernblot的原理与Southernblot相比有三点不同:(1)检测的对象不同.(2)变性方法是不同的,它不能用碱变性,因为碱变性会导致RNA的降解.(3)探针不同.第9页/共53页3、Westernblot通过抗体与靶蛋白的抗原特异性反应检测蛋白质样品。主要用于基因在蛋白质水平上的表达研究。第10页/共53页Westernblot的原理与Southernblot相比有两点不同:(1)检测的对象不同.(2)探针的性质不同,在Westernblot中使用的探针是抗体(蛋白质)第11页/共53页

将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）第五节基因文库构建第12页/共53页（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb第13页/共53页断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②酶切法：第14页/共53页（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。第15页/共53页各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾第16页/共53页第17页/共53页4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）第18页/共53页例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第19页/共53页1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文库的构建mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。第20页/共53页（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。第21页/共53页分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）第22页/共53页第23页/共53页反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物第24页/共53页用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH碱第25页/共53页剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’③cDNA第二链合成第26页/共53页④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’第27页/共53页第28页/共53页这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。第29页/共53页mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物第30页/共53页第31页/共53页在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶第32页/共53页第33页/共53页6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n第34页/共53页第六节酵母双杂交系统YeastTwoHybridSystem(Interactiontrap)90年代，纽约大学的S.Field等建立。第35页/共53页有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质二、酵母双杂交系统的原理许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。1.结构域（Domain）合作一、酵母双杂交系统的作用第36页/共53页例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNAbindingdomainActivedomainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因结合结合激活转录只要DNAbindingdomain（DNA-BD）与Activedomain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。实验发现：转录表达第37页/共53页2.拆开DomainDNAbindingdomainActivedomain上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因结合用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。不能转录第38页/共53页3.重组Domain用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。Activedomain蛋白A蛋白BDNAbindingdomain在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。通过效应基因是否被激活来检查：4.观察报告基因表达第39页/共53页上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因蛋白ADNAbindingdomain转录激活domain蛋白BGAL4的DBdomain与ADDomain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。不能转录（1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合第40页/共53页上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因蛋白ADNAbindingdomain转录激活domain蛋白B激活转录GAL4的DBdomain与ADDomain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。转录表达（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合第41页/共53页双杂交原理X基因和Y基因产物的相互结合，导致reportergene表达。Reportergene表达就可说明X基因产物与Y基因产物能结合。第42页/共53页三、构建双杂交体系的宿主菌

删除基因组中的内源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。如：SFY526;HF7c等菌株。四、构建报告基因（reportergene）GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。此外还有其他营养缺陷。第43页/共53页1.穿梭质粒（shuttleplasmid）五、构建双杂交体系的穿梭质粒既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。2.双杂交体系需要两种穿梭质粒分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。第44页/共53页靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。（1）BD-plasmidP:ADH1启动子。T:ADH1终止子。筛选标志：TRP核定位信号是GAL4本身的一部分ADH：Alcoholdehydrogenase第45页/共53页（2）AD-plasmid外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后。P:ADHI启动子。T:ADHI终止子。筛选标志：LEU2核定位信号是SV40的T抗原的序列第46页/共53页六、酵母双杂交的实验过程1.把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9）2.把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424）3.两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c