基因工程育种

基因工程育种第1页/共63页第一节基因工程育种概述第二节重要的工具酶第三节常用的载体第四节基因工程育种基本过程第五节基因工程育种的应用主要内容第2页/共63页第一节基因工程育种概述第3页/共63页Cohen和Boyverl973年首次成功完成了DNA分子的体外重组实验，宣告基因工程(geneengineering)的诞生，也为微生物育种带来了一场革命。

基因工程育种

广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。第4页/共63页基因工程育种的优势与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、植物、微生物之间的杂交。同时，利用基因工程方法，人们可以“随心所欲”地进行自然演化过程中不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。这是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的育种技术，是最新、最有前途的育种方法。第5页/共63页第二节重要的工具酶第6页/共63页工具酶

基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。第7页/共63页一、限制性核酸内切酶(RE)

是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。

根据限制酶的作用特性，一般分为三类：

——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

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限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种缺口：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平头末端

回文序列是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;

粘性末端是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的碱基序列，相互具有互补性。第9页/共63页第10页/共63页其它特殊性质的Ⅱ型限制酶同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶第11页/共63页同裂酶

又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。第12页/共63页同裂酶——同识同切第13页/共63页同裂酶——同识异切第14页/共63页同尾酶

同尾酶

指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。第15页/共63页可变酶可变酶

识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，BstpⅠ，其识别顺序为GGTNACC。第16页/共63页

常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称酶名称识别顺序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢杆菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大肠杆菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普罗威登细菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色链球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ第17页/共63页二、DNA聚合酶

（最常用的DNA聚合酶有以下4种）

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段

TaqDNA聚合酶

T4噬菌体DNA聚合酶第18页/共63页㈠DNA聚合酶Ⅰ

E.Coli

DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：

5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性

5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性

3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性第19页/共63页DNApolⅠ应用⑴催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA

探针；⑵第二条cDNA链的合成；⑶对DNA3ˊ突出末端进行标记；⑷DNA序列分析。第20页/共63页E.coliDNApolⅠ催化切口平移第21页/共63页㈡Klenow片段（DNApol.大片断）第22页/共63页

Klenow片段用途⑴补齐双链DNA的

3ˊ末端；⑵用标记碱基补齐3ˊ末端；

⑶在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；⑷

DNA序列分析。第23页/共63页

㈢TaqDNApol（耐热DNA聚合酶）

作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围

7075℃，2）95℃以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。第24页/共63页三、逆转录酶

特点

逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的

RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。第25页/共63页

逆转录酶的应用：⑴将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。第26页/共63页四、DNA连接酶(DNAligase)

DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。

DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来

5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA连接酶

5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修补带有缺口的双链DNA分子T4DNA连接酶第27页/共63页五、碱性磷酸酶

碱性磷酸酶(BAP)能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。用途⒈制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。⒉用32P标记5'-端前，去除5'-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。第28页/共63页六、末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)

作用

将标记或未标记的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用①探针标记

P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32

②在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接第29页/共63页重要的工具酶工具酶

活性限制性核酸内切酶

识别特异序列，切割DNAT4DNA连接酶

催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶

以DNA为模板合成DNA逆转录酶

以RNA为模板合成DNA碱性磷酸酶

切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶

催化核酸5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶

催化3'-端合成同聚体尾第30页/共63页第三节常用的载体第31页/共63页载体(vector)

是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA。

载体必须具备的基本条件载体的种类常用的载体第32页/共63页一、载体必须具备的基本条件⒈有自身的复制子，能独立复制⒉具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)⒊具有遗传表型或筛选标记⒋有足够的容量以容纳外源DNA片段。⒌表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。⒍载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入该非必需区，而载体本身不受影响。第33页/共63页二、载体的种类（一）克隆载体

用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性：⑴能够在受体细胞复制；⑵带有药物抗性基因，便于筛选；⑶可导入受体细胞。（二）表达载体除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件——转录和翻译所必须的DNA顺序。第34页/共63页三、常用的载体

（一）质粒(plasmid)：

是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。

作为克隆载体的质粒应具备以下特点：

1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数

2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选

3.具有多克隆位点

第35页/共63页广泛应用的质粒：

pBR32质粒、pUC系列等第36页/共63页

pBR322质粒①4363bp②含一个复制点含一个抗氨卞青霉素标记(ampR)④一个抗四环素标记(tetR)⑤ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入当外原基因插入抗药基因位点时，AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).第37页/共63页pUC系列质粒

由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampr和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断,编码半乳糖苷酶第38页/共63页(二)λ噬菌体

组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。第39页/共63页

λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长

溶菌性生长（lyticpathway）噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。

溶源性生长(lysogenicpathway)

噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。第40页/共63页

第四节基因工程育种基本过程第41页/共63页

基因工程原理第42页/共63页一、目的基因的获取（分）目的基因是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。

基因工程育种基本过程第43页/共63页1、获取目的基因来源

1）制备基因组DNA2）制备cDNA3）聚合酶链反应

4）人工合成基因第44页/共63页

二、目的基因与载体的连接（接）

（主要有以下4种连接方式）

1)粘性末端连接

2）平头末端连接

3）人工接头法

4）同源多聚尾连接法第45页/共63页2、重组第46页/共63页三、重组DNA导入宿主细胞（转）

第47页/共63页重组DNA导入宿主细胞的类型转化以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。

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四、重组DNA的筛选与鉴定（筛）（筛选含重组DNA的阳性克隆）第49页/共63页筛选一般有下列几种方法：

1平板筛选

2限制酶切图谱筛选

3PCR筛选重组体

4原位杂交技术插入失活蓝－白筛选第50页/共63页1平板筛选

是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。

1）插入失活

当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。第51页/共63页

抗生素平板筛选（插入失活）第52页/共63页2）蓝-白斑筛选

它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。

载体：编码β-半乳糖宿主：编码β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列

互补细菌表达：

β-半乳糖苷酶活性蛋白↑5-溴-4-氯-3-吲哚（

X-gal）→

形成蓝色菌落

当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行互补→产生白色菌落。

（IPTG存在下）

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蓝－白筛选示意图第54页/共63页2.限制性内切酶图谱鉴第55页/共63页3.PCR筛选重组体

抽提少量重组DNA→PCR扩增→电泳鉴定→序列分析。4.原位杂交第56页/共63页