基因工程常用技术

基因工程常用技术第1页/共122页

质粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技术，最常用的是碱裂解法。一、质粒DNA的提取第2页/共122页

在强碱性溶液中，DNA双链的氢键断裂变性；当溶液恢复中性时，DNA双链复性。（一）碱裂解法提取质粒DNA1、原理第3页/共122页4

在变性后双链不分离、复性快。共价闭合环状的质粒DNA：第4页/共122页5强碱性

变性后双链分离、难以复性而形成缠绕结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，离心时沉淀。线性染色体DNA：第5页/共122页2、碱裂解法质粒DNA提取的步骤1）溶菌使用“溶液I”溶解细菌细胞壁。溶液I：50mM葡萄糖25mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA4-5mg/ml溶菌酶第6页/共122页7葡萄糖：

增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。EDTA：Mg2+、Ca2+螯合剂，抑制DNase活性，防止DNA被降解。第7页/共122页8溶菌酶：

为糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分--肽聚糖中的-1,4糖苷键，具有溶菌作用。第8页/共122页2）变性

加入“溶液II”，使细菌细胞膜破坏、使蛋白质和DNA变性。溶液II：

0.2NNaOH（10N贮存液现用现稀释）

1%SDS第9页/共122页10NaOH：

是强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。

是离子型表面活性剂，溶解细胞膜和细胞内蛋白，并结合成“蛋白质-SDS”复合物，使蛋白质（包括DNase）变性沉淀。SDS：第10页/共122页113）中和

加入“溶液III”使DNA复性、蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。溶液III：

5NKAc60ml

冰HAc11.5ml

水8.5ml第11页/共122页12KAc：

用冰HAc把KAc溶液的pH调到4.8，以中和NaOH变性液，使DNA复性。

高浓度KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、蛋白质-SDS复合物沉淀。冰HAc

：第12页/共122页13上清液中含有质粒DNA。4）离心去除沉淀第13页/共122页5）纯化DNA

酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提或柱层析。第14页/共122页15酚：

比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚。

蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。

防止抽提时振荡起泡。氯仿：异戊醇：第15页/共122页16

2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。6）沉淀DNADNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。第16页/共122页1770%乙醇洗涤DNA，干燥。7）洗涤8）贮存用含RNaseA(20g/ml)的TE溶解DNA，贮存于-20℃。第17页/共122页18TE：

由Tris-HCl缓冲液和EDTA配制。

EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。

Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸或硼酸缓冲液），利于后续操作。

RNaseA：

降解残留的RNA。第18页/共122页

许多公司研制出商品化质粒提取试剂盒，原理大多依照碱裂解法，但在纯化步骤上采用柱层析。第19页/共122页203、影响质粒DNA产量的因素

质粒的产量受提取过程中各因素的影响，但最重要的是菌株的遗传背景和质粒自身的拷贝数。第20页/共122页

一般使用endA基因突变的E.coli菌株，如DH5、JM109等。1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶I，在Mg2+存在下，可将双链DNA消化为7bp的寡核苷酸片断。第21页/共122页22是直接决定DNA产量的重要因素之一。2）质粒拷贝数3）质粒大小分子量大的质粒拷贝数低。第22页/共122页常用质粒的理论产量pUCpGEMpBR322ColE1pSC1012.7kb2.7kb4.4kb4.5kb9.0kb500-700300-700>25>15≈62.9-4.11.8-4.1>0.32>0.15≈0.12质粒分子大小拷贝数质粒产量（kb）（g/ml）第23页/共122页（二）DNA的定量和纯度测定1、紫外光谱法原理：基于DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰（蛋白质在280nm处有吸收峰），用微量比色杯在紫外分光光度计直接测定。第24页/共122页

在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml。第25页/共122页26纯DNA样品：OD260/OD280=1.8OD260/OD230>2.0OD260/OD230<2.0：有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。OD260/OD280<1.6：有蛋白质污染；OD260/OD280>1.9：有RNA污染；第26页/共122页27原理：利用溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中，在紫外光照射下能发红色荧光，将其荧光强度与已知浓度的DNA(如DNAmarker)电泳条带对比，可估算出DNA含量。2、琼脂糖凝胶电泳估计第27页/共122页（三）DNA分子量的估计

通过琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNAmarker对比得知。第28页/共122页二、核酸凝胶电泳技术（一）电泳的基本原理

生物大分子在一定pH条件下，通常带电荷，将其置于电场中，会以一定的速度向与其电荷性质相反的电极迁移，迁移速度称电泳速率。第29页/共122页30

摩擦系数与分子的大小、构型及介质的粘度有关。

电泳速率与电场强度、分子所带的净电荷数成正比，与分子与介质的摩擦系数成反比。第30页/共122页

在生理条件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态，故DNA实际上呈多聚阴离子状态，在电场中向方向迁移。

糖-磷酸骨架在结构上重复，故等量的双链DNA几乎带等量的净电荷。正极第31页/共122页32

如电场强度一定、电泳介质相同，电泳速率就取决于核酸分子的大小和构型。构型相似的分子：分子量越大、迁移越慢。分子量相同的分子(如质粒)：

cccDNA迁移最快、L-DNA次之、ocDNA最慢。第32页/共122页33第33页/共122页第34页/共122页固体支持介质：琼脂糖(agarose)聚丙烯酰胺(polyarylamide)

固体支持介质可形成复杂的网孔结构，DNA穿过这些网孔才能到达正极。

分子量小、结构致密的DNA分子更易穿过网孔，泳动速度也越快。第35页/共122页（二）琼脂糖凝胶电泳

是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖：第36页/共122页37琼脂糖凝胶：

琼脂糖在电泳液中加热到沸点后溶解，冷却后凝固成均匀的胶体“胨”，成为很好的电泳介质。第37页/共122页38琼脂糖浓度(%)分离DNA的范围(kb)0.3

5-600.6

1-200.7

0.8-10

0.9

0.5-71.2

0.4-61.5

0.2-42.0

0.1-3

琼脂糖浓度的高低决定凝胶孔隙的大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。第38页/共122页（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺：

由丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚合而成。

第39页/共122页40

在过硫酸铵和TEMED存在时，丙烯酰胺单体形成长链，由N,N’-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由基团反应而发生交联，形成聚丙烯酰胺。第40页/共122页

为中枢神经毒物，尽量避免接触和吸入!过硫酸铵：

催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合。丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺：

碱性条件下产生自由基。TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二铵)：第41页/共122页42聚丙烯酰胺浓度(%)分离DNA的范围(bp)3.51000-20005.085-500

8.060-40012.040-200

15.025-150

20.06-100

聚丙烯酰胺浓度的高低决定凝胶孔隙的大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。第42页/共122页43聚丙烯酰胺凝胶的优点：

比琼脂糖凝胶的分辨率高得多。0.3-2%琼脂糖凝胶电泳分辨率：60,000-100bp；3.5-20%聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率：2,000-6bp。第43页/共122页44（四）电泳缓冲液Tris-乙酸（TAE）

Tris-硼酸（TBE）Tris-磷酸（TPE）TAE价格便宜，但缓冲容量低；

TBE与TPE缓冲容量高，分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，易使DNA沉淀。推荐使用第44页/共122页45EDTA可螯合二价阳离子，抑制DNase活性，防止DNA被降解。临用时用水稀至0.5TBE（20倍稀释）10TBE缓冲液的配制：

Tris碱108g

硼酸Boricacid55g

EDTA9.3g

加H2O至1L（调PH为8.0-8.2）第45页/共122页46（五）核酸电泳的指示剂与染色剂1、指示剂：

常用溴酚兰，在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，迁移率分别与1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。第46页/共122页47使样品呈色，便于加样操作；指示剂与蔗糖、甘油组成加样缓冲液。增加样品比重，确保DNA均匀沉入加样孔；在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测DNA电泳的速度和位置。加样缓冲液的作用：第47页/共122页48第48页/共122页492、染色剂：

核酸电泳后，需经染色才能显出带型。溴化乙锭染色法银染色法第49页/共122页50

溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)能插入到DNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出红色荧光。1）溴化乙锭染色法：第50页/共122页51

可将EB直接加到凝胶介质中（终浓度0.5g/ml）；也可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10-15min。EB与DNA分子结合，而不与凝胶结合，DNA分子吸收EB并发出荧光。第51页/共122页52

琼脂糖凝胶EB染色后，在紫外光下观察，可检测出≥50ng的DNA。

在适当染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。第52页/共122页532、银染色法：Ag+可与核酸形成稳定的复合物，用还原剂(如甲醛)使Ag+还原成银颗粒，可将电泳条带染成黑褐色，用于聚丙烯酰胺凝胶染色。优点：灵敏度比EB高200倍。缺点：银染色后，DNA不宜回收。第53页/共122页聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染结果银染10min银染15min第54页/共122页三、核酸分子杂交技术1968年，华盛顿卡内基学院的RoyBritten及其同事发明。目的：用特异探针鉴定复杂靶DNA中的同源片段。第55页/共122页DNA与DNA杂交：A=T、G≡C

DNA与RNA杂交：A=U、G≡C依据：碱基互补、变性和复性随温度逐渐降低，变性的两条单链重新形成互补双链。在高温下，核酸双链解为两条单链；碱基互补变性：复性：第56页/共122页

利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针(probe)，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补同源核酸序列的存在。第57页/共122页（一）核酸探针

指一段带有检测标记、与目的DNA片段特异互补、已知序列的核酸片段。探针长度一般以50-300bp为宜。第58页/共122页核酸探针的种类：放射性探针非放射性探针根据核酸性质不同，分为：RNA探针寡核苷酸探针DNA探针cDNA探针根据标记方法不同，分为：第59页/共122页

寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)简并探针组成的寡核苷酸探针库6个氨基酸连续序列→倒推基因序列→人工合成单一已知序列的寡核苷酸探针已知序列→人工合成第60页/共122页根据生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针；简并探针的设计依据：参考生物体EST(expressedsequencetag)数据库，进行倾向性简并序列设计。EST：对一个随机选择的cDNA克隆，进行5’端和3’端单一次测序，获得的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，平均长度360±120bp。第61页/共122页寡核酸探针的优点：序列短，杂交速度快、特异性强；可在短时间内大量制备；可在合成中进行标记；可合成单链探针，避免双链探针在杂交中自我复性，提高杂交效率；可检测靶序列内1个碱基的变化。第62页/共122页寡核苷酸探针的设计原则：长度18-50bp；分子内部不含互补区；GACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGCAG+C含量40-60%；避免同一碱基连续出现（不能多于4个）；与非靶序列70%以上同源性、或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。第63页/共122页641、标记物的种类：

前者更敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。非放射性：生物素、地高辛、荧光素等。放射性：32P、35S、125I等；（二）核酸探针的标记第64页/共122页缺刻平移法随机引物延伸法反转录标记法末端标记法2、探针标记方法：1）放射性同位素标记：第65页/共122页5’…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’1）Klenow酶介导的3’末端标记法：KlenowdNTPs（-32P-dATP）5’…G-C-T-G-A-A-T-TA-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-AT-T-A-A-G-C-T-C…5’末端标记法第66页/共122页675’3’3’5’AA-32P-ddATPTdT5’5’2）TdT介导的3’末端标记法：

第67页/共122页3）T4-PNP介导的5’末端标记法：5’P3’HOOH3’P5’

5’HO3’HOOH3’OH5’

CIPT4-PNP-32P-ATP5’P3’HOOH3’P5’第68页/共122页692）非放射性同位素标记：

酶促反应标记法化学修饰标记法第69页/共122页

将标记物预先标记在核苷酸分子上，再利用酶促反应，将标记的核苷酸掺入探针中。酶促反应标记法1）标记物-dUTP的生成；（如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP）2）将标记物-dUTP作为DNApolI的底物，掺入DNA分子中。第70页/共122页71Bio-11-dUTP：生物素(Biotin)Biotin与dUTP之间连接臂的碳链长度。11：Bio：

广泛存在于各种组织中，若样品本身含内源性生物素，会对结果产生干扰。第71页/共122页72Dig-11-dUTP：地高辛(digoxigenin)；Dig：

洋地黄植物的花和叶是Dig在自然界中的唯一来源，抗Dig抗体不会与其他生物物质结合，可满足特异性标记的需要。

从洋地黄植物中提取的类固醇物质。第72页/共122页地高辛系统标记：DIG-11-dUTPDIG抗体-显色酶交联复合物第73页/共122页化学修饰标记法

利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应，将标记物直接结合到探针分子上。第74页/共122页ABC荧光标记：荧光胺Avidin链亲和素GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素烷烃连接臂ABC：AvidinBiotinComplex第75页/共122页ABC显色酶标记：GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素烷烃连接臂显色酶生色底物颜色产物Avidin链亲和素ABC：AvidinBiotinComplex第76页/共122页（三）核酸分子杂交的分类

待测核酸样本先结合到固相支持物（硝硝酸纤维素膜、尼龙膜等）上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。

待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应。液相杂交：固相杂交：第77页/共122页液相核酸分子杂交第78页/共122页固相核酸分子杂交制备待测核酸样品制备核酸探针分离、变性、转印、固定与杂交液预杂交标记漂洗去除未参与杂交的标记探针检测杂交信号杂交加入标记核酸探针预杂交：消除膜对探针的非特异性结合，降低杂交背景。第79页/共122页Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点杂交/狭缝杂交菌落杂交夹心杂交原位杂交常用固相核酸杂交方法第80页/共122页1、Southern印迹杂交

是将DNA分子从电泳凝胶转印到硝酸纤维素膜上，进行核酸杂交的一种实验方法。

1975年，由英国爱丁堡大学的EdwenSouthern创建，故称Southernblot。第81页/共122页

提取DNA样本→限制酶酶切→琼脂糖凝胶电泳分离→NaOH变性→DNA转印至膜上→预杂交→标记探针与之杂交→放射自显影或显色反应→检测杂交信号→结果分析。Southernblot的基本过程：用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。第82页/共122页83第83页/共122页水稻叶绿体DNA分别用BglII(A-C)、BamHI(D-F)、EcoRI(G-I)、HindIII(J-L)消化，琼脂糖凝胶电泳分离，然后与32P标记的玉米psbA探针Southern杂交，X光底片中显现阳性条带，表明含玉米psbA基因序列。第84页/共122页2、Northern印迹杂交1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素膜上，进行核酸杂交的一种实验方法。方法与Southernblot类似，故称Northern印迹杂交（Northernblot）。第85页/共122页

提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转印至膜上→预杂交→标记探针与之杂交→放射自显影或显色反应→检测杂交信号→结果分析。Northernblotting的基本过程：用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。第86页/共122页87第87页/共122页3、斑点杂交/狭缝杂交（spot/slotblothybridization）基本过程：

将变性的DNA或RNA直接点到膜上，或通过一个长形狭缝转印至膜上→膜变性→预杂交→标记探针与之杂交→放射自显影或显色反应→检测杂交信号→结果分析。第88页/共122页DNA样品使用特殊设计的加样装置，可使众多待测样品一次同步转印至杂交膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。点样Probe-32P检测AB1234第89页/共122页90简便、快速、灵敏、样本用量少。特异性不高，有一定比例的假阳性。优点：缺点：第90页/共122页AB固相支持物固相吸附探针标记检测探针

需两个靠近且不重叠的探针，一个作固相吸附探针，另一个作标记检测探针。4、夹心杂交(sanwichhybridization)第91页/共122页优点：样品不需固定，对粗制样品即能做出可靠的检测。特异性强，只有两个探针都杂交时，才能产生可检测的信号；第92页/共122页93注意：

为避免产生高本底信号，两探针必须分别克隆入两个非同源载体内，如一个克隆入PUC19，另一克隆入pBR322。第93页/共122页5、菌落杂交(colonyhybridization)基本过程：将菌落从平板转移到硝酸纤维素膜上→裂解菌落、释放DNA→将DNA烘干固定于膜上→标记的探针与之杂交→放射自显影→检测杂交信号→与平板上的菌落对位。第94页/共122页

用于从大量菌落中筛选含特异DNA序列的目的重组子。第95页/共122页6、原位杂交(insituhybridization,ISH)

是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性、定量及定位分析。第96页/共122页97优点：

不需提取核酸，可完整保持组织或细胞的形态，更准确地反映组织细胞的功能状态。FISH检测HER-2基因在乳腺癌组织中的表达FISH检测慢性粒细胞白血病的费城染色体(22和9号染色体异位)第97页/共122页

是利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。

四、聚合酶链反应技术（polymerasechainreaction,PCR）第98页/共122页1、模板:

（一）PCR反应系统的组成

无论哪种DNA，都要有较高的纯度。

质粒-DNA染色体DNA大小较小较大非常大目的基因单拷贝变性易较难难用量

lng300-500ng可以是DNA或RNA。第99页/共122页mRNAcDNAPCR，称为RT-PCR。逆转录RNA作为模板时，需要：RT-PCR：ReverseTranscription

PCR

第100页/共122页

是根据模板DNA待扩增区两端的序列而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为15-30bp，最多不超过50bp。

3、引物2、TaqDNA聚合酶第101页/共122页引物设计的原则：长度适宜，一般15-30bp；G+C含量40-60％；4种碱基应随机分布；内部不应存在互补序列；两条引物之间不应有多于4个碱基的互补；3’端不应有任何修饰；5’端可修饰，如32P、生物素、荧光素。第102页/共122页上游引物5’端：

起始密码子ATG；注意：下游引物5’端：

终止密码子TAA、TAG或TGA；上、下游引物5’端：

限制酶识别序列及其保护碱基。第103页/共122页1045’GGAATTCCCTATGACCCAG3’不同限制酶需保护碱基的数量不同，如：

EcoRI1HindIII>3BamHI2-3PstI>4保护碱基数量不合适，会影响限制酶酶切。保护碱基第104页/共122页4、dNTPs

终浓度：50mol/L，4种dNTPs浓度应相等。注意：不稳定，保存时间长会失效.第105页/共122页1）不同的酶需不同Mg2+：5、Mg2+：Taq酶：0.5-1.5mM；pfu酶：2-3mM；

dNTP、引物用量约增加1倍。第106页/共122页107EDTA鳌合Mg2+；选择低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；如扩增效率不理想，注意调整Mg2+浓度！2）外界影响：DNA模板、引物、dNTPs的磷酸基团均可结合Mg2+。第107页/共122页模板DNA

0.1-2g引物各10-100pmolTaq酶2.5U4种dNTP混合物各200mol/LMg2+

1.5mmol/LddH2O标准的PCR反应体系：100L第108页/共122页1、变性温度：

（二）PCR参数94-95℃，一般30-45sec。

模板DNA完全变性对RCR能否成功至关重要。可95℃加热3-5min预变性。第109页/共122页1102、退火温度：Tm：50％的引物和