基因工程-工具酶中国药科大学生物工程所有

基因工程—工具酶中国药科大学生物工程所有第1页/共162页自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。第2页/共162页基因工程工具酶

限制性内切酶连接酶

DNA聚合酶

DNA修饰酶

RNA聚合酶磷酸激酶和磷酸酶核酸酶第3页/共162页一、细菌的限制—修饰作用和限制性内切酶的发现第一节限制性核酸内切酶①50年代后Luria和Human(1952)Bertani和Weigle(1953)发现细菌的“限制”现象.1、细胞的限制—修饰作用第4页/共162页Phageλ（k）感染E.colik不感染E.coliB(E.coliB限制λ（k）)②仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因

E.coliB对λ(K)进行了修饰。E.coliB修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰？第5页/共162页①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在Phage入的DNA上。

②1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌的限制—修饰系统第6页/共162页即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称R-Msystem限制性内切酶识别特异的DNA序列并打断DNA，同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化，使得限制性内切酶无法识别。这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来入侵的DNA在限制性内切酶的作用下被水解，而细菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护起来。

细菌的限制和修饰现象第7页/共162页第8页/共162页

①1968年Linn和Arber从E.coliB中发现限制酶,M.Meselson和R.yuan从E.coliK中分离到另一限制性的内切酶。1970年Smith(美)在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶Ⅱ。②限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。③1978年W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖。限制性内切酶的发现第9页/共162页二、限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease）第10页/共162页2.性质内切酶。原核生物。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。自我保护作用。3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源第11页/共162页限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）第12页/共162页细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶(Mec甲基化酶)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基第13页/共162页第14页/共162页1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。第15页/共162页4.

限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。2.

用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3.

如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。第16页/共162页EcoRIEscherichia属名Coli种类Ry13株系编号

若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。第17页/共162页I型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。四、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶第18页/共162页首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。（1）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I类限制性内切酶如EcoB和EcoK。未甲基化修饰的特异序列，非对称性。第19页/共162页需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点第20页/共162页I类酶与DNA识别位点结合依赖于M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的相互作用，后者通过变构作用使酶处于活性状态。酶分子与识别位点结合之后，根据该位点的甲基化状态发挥相应的酶活性，或限制、或修饰、或既不限制也不修饰。I类酶的切割位点与识别位点通常相距1,000-5,000bp，切割位点的序列并不表现出严格的特异性，两条DNA链上的断裂位点相距70-75个核苷酸，因此切开的DNA分子末端是单链形式。第21页/共162页如果识别位点是全甲基化的，则ATP使酶-SAM复合物脱离DNA双链；如果识别位点是半甲基化的(即只有一条链甲基化)，则酶-SAM复合物在ATP的帮助下使非甲基化的DNA链甲基化，同时SAM转变为相应的S-腺苷高半胱氨酸(SAH)；如果识别位点没有甲基化，ATP可使酶分子再次变构，暴露出限制性内切酶的活性部位，先释放SAM，然后以一种未知的机制在切割位点处将双链DNA切断，同时消耗ATP。第22页/共162页首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。II类限制性内切酶分离的第一个酶是HindⅡ该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双链DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组及分子生物学实验中被广泛使用。第23页/共162页（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA；四、五或六个碱基对，而且具有180°旋转对称的回文结构。与DNA的来源无关。5‘

…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘

…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点第24页/共162页绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶（Isoschizomers），其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶，如SstI与SacI、HindIII与HsuI等。有些酶识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶（Isocandamers）。根据被切开的DNA末端性质的不同，所有的II类酶又可分为5’突出末端酶、3’突出末端酶以及平头末端酶三大类。II类酶分类第25页/共162页（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处。EcoRV5’-GATÜATC-3’

3’-CTAÛTAG-5’Sam

I5’-GGGCGC-3’3’-CCCGGG-5

EcoRI5’-GÜAATTC-3’3’-CTTAAÛG-5’PstI5’-CTGCAÜG-3’3’-GÛACGTC-5’

产生粘性末端产生平齐末端第26页/共162页（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链突出的末端。分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）GÜAATTC

CTTAA

GGAATTCCTTAAÛG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’第27页/共162页CTGCAÜG

②3’端凸出（如PstI切点）GÛACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

GACGTC第28页/共162页①连接便利（4）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。第29页/共162页第30页/共162页③补平成平齐末端凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。第31页/共162页识别位点的序列相同的限制性内切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶(同位酶)：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AÜAGCTT-3’3’-TTCGAÛA-5’HsuI5’-AÜAGCTT-3’3’-TTCGAÛA-5’第32页/共162页XmaI5’-CÜCCGGG-3’3’-GGGCCÛC-5’SmaI5’-CCCÜGGG-3’3’-GGGÛCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：第33页/共162页识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（6）同尾酶(Isocaudamers）5’-GÜGATCC-3’3’-CCTAGÛG-5’BamHIBclI5’-TÜGATCA-3’3’-ACTAGÛT-5’

5’-AÜGATCT-3’3’-TCTAGÛA-5’BglⅡ5’-UÜGATCY-3’3’-YCTAGÛU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。第34页/共162页5’-ÜGATC----3’3’----CTAGÛ-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的“杂种位点”一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A第35页/共162页第36页/共162页限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。（7）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。①星号（*）活性

星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。第37页/共162页第38页/共162页EcoRI和BamHI等都有*活性,使用时要注意！！在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：如：ECORI★识别特异性放宽，GAATTC→AATT第39页/共162页较高的甘油浓度（>5%v/v）；酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>100U/µg）；低盐浓度（<25mM）高pH值（>pH8.0）存在有机溶剂（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等）用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）导致星号活性的因素第40页/共162页以下酶类易出现“星号活性”，它们是

BamHI，Bcl

I，BseBI，BssAI，EcoRI，EcoRV，HindIII，HpaI，Kpn

I，NcoI，NruI，Pst

I，PvuII，SalI，ScaI，SnaBI，SphI，SspI，XbaI。以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoRI比PstI对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些(2)。第41页/共162页尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。将反应缓冲液的pH值降到7.0。二价离子用Mg++。

抑制星号活性的方法第42页/共162页在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（8）Ⅱs型限制性内切酶移动切割（shiftedcleavage):GACGCNNNNNä

HgaICTGCGNNNNNNNNNNã5’3’第43页/共162页3.III类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG第44页/共162页III类限制-修饰酶由R亚基和MS亚基组成，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖ATP，在与识别位点结合之后，修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行，甲基化受体是腺嘌呤碱基，供体仍为SAM。切割位点位于识别位点一侧的若干碱基对处，但无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同的III类酶具有各自不同的距离，从7至26bp不等。第45页/共162页第46页/共162页五、影响限制性内切酶活性的因素

1、底物DNA1)DNA的纯度DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。

RNA与E结合影响有效酶浓度；RNA影响(干扰)电泳区带。

2)DNA浓度〔DNA〕过大，会抑制酶活(影响酶分子扩散)。第47页/共162页

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl在37℃下15h

而1μgDNA/1UHPaⅠ50μl在37℃下1h3）识别位点及邻近位点特异性序列

由于切点邻近序列不同，水解速度不同。如：①λDNA有5个ECORI切点，其中两个相差10倍。②pBR322DNA有4个NarⅠ切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。③XmaⅢ切点是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC时不切割第48页/共162页4)DNA二级/三级结构

超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需更多酶。5)提取时混入杂质可改变识别特异性

如：高浓度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTASDS、NaCl等。第49页/共162页大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。第50页/共162页不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。504525BanIMaeISmaI306055ApyIBstEIIMaeIII30505065ApaIBclIMaeIITaqI最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oC酶3.温度第51页/共162页是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)（1）缓冲液的化学组成金属离子①如Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，ECORI）则特异性改变。②离子浓度，合适→激发酶活；不合适→抑制酶活。

牛血清蛋白(BSA)第52页/共162页MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；BSA是酶稳定剂，机制：减少蛋白酶及非特异性吸附作用。避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾。可通过加SDS/65℃/5min除去。

水无离子水，ddH2O，双蒸水。无菌、无污染、配成核心缓冲液，即几种酶的相近buffer商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。第53页/共162页六、限制性内切酶对DNA的消化1.内切酶与识别序列的结合模式1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG第54页/共162页内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。2.完全消化12341234第55页/共162页只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。3.局部消化123414第56页/共162页大多数酶可用65oC温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。4.限制酶酶切反应的终止5.几种常用限制酶识别位点第57页/共162页第58页/共162页要做定向克隆，通常要作双酶切。同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。酶切所用的缓冲液可以从各公司的酶活性图表中选择。6.双酶切第59页/共162页第60页/共162页双酶切注意事项

选活性至少都在80％以上的buffer

注意反应温度

1）温度一致时可同时进行

2）温度不一致时，先切温度低的，再切温度高的如果找不到同时适合两种酶的缓冲液，可以按两种酶的条件按顺序进行酶切反应。先用需要在低盐条件下反应的限制性内切酶来切割，然后提高盐浓度以完成第二次切割。最好先切一个，回收后再切另一个.第61页/共162页由于内切酶在非最佳缓冲液中进行双酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长酶切时间来提高酶切速率。第62页/共162页从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二节DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口。第63页/共162页DNA连接酶旧称“合成酶”。是1967年在三个实验室同时发现的，最初发现于大肠杆菌。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5‘-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。第64页/共162页（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。分子量74000dal,辅因子NAD+,其作用是封闭双螺旋骨架上具有5‘-磷酰基和3’-羟基的缺口，形成磷酸二酯键。二、DNAligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶T4DNA连接酶来自于T4噬菌体感染的E.coli，为T4噬菌体自身的表达产物。分子量6.8万dal，辅因子位ATP，该酶既能连接粘性末端，亦能连接齐平末端。第65页/共162页（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+2.连接条件第66页/共162页1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、连接反应的机理2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi第67页/共162页4.AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP第68页/共162页5.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。第69页/共162页

用DNA连接酶，可催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组分子。具体做法是，在体外将具有粘性末端的DNA限制片断，插入到适当载体分子上，再用DNA连接酶连接，从而可以按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子。粘性末端DNA片段的连接（连接酶的作用）

第70页/共162页同种内切酶生产的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG第71页/共162页用粘性末端构建重组体DNA的最主要缺点：1、无法控制外源基因的插入方向；2、由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应混合物中会发生自我环化作用，经连接酶作用，形成共价闭环的稳定环形结构。克服该缺点的方法是，用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，以移去末端的5‘磷酸基团，于是在连接反应中，它自身的两个末端之间就再也不能被连接酶共价连接起来了。第72页/共162页第73页/共162页1、同聚物加尾法

是由美国斯坦福大学的P.Labban和D.Kaiser1972年发展起来的，可以连接任何两段DNA分子的普遍性方法。原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP)加到DNA分子单链延伸末端的3‘-OH上。如果在目的基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。长度一般10~40个残基。

平末端DNA片段的连接

第74页/共162页同聚物加尾法优点:1)首先不易自身环化.2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高.3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接.缺点：1)插入的片段难以回收。2)无法控制外源基因插入方向。3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接.第75页/共162页人工粘性末端的连接

平头末端C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG第76页/共162页人工粘性末端的连接

3‘突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI第77页/共162页人工粘性末端的连接

5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHI第78页/共162页衔接物（linker)连接法所谓衔接物是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。将衔接物的5‘末端和待克隆的DNA片段的5’末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。优点：克隆后还可回收原插入片断。第79页/共162页第80页/共162页第81页/共162页DNA衔接物连接法尽管有诸多优点，但明显的缺点是，如果待克隆的DNA片段或基因的内部也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成麻烦。第82页/共162页DNA接头(adaptor)连接法DNA接头是由美国康奈尔大学吴瑞博士于1977年发明的，它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。问题：各个DNA接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子，失去接头的本来意义。克服的方法是将5‘末端的磷酸修饰移去，其结果为暴露出的5’-OH所取代。如此一来，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力，但终因DNA连接酶无法在5‘-OH和3’–OH之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定的二聚体分子。第83页/共162页第84页/共162页第85页/共162页连接酶反应的最佳温度是37°C。四、连接反应的温度1.最佳温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。2.实用温度所以一般采用4~16°C。第86页/共162页增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1.插入片段与载体的浓度比例2.反应温度五、影响连接反应的因素10~20倍。一般14~16℃第87页/共162页第三节DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli)Klenowfragment(E.coli)T４DNA聚合酶(T４Phage感染的E.coli)T７DNA聚合酶(T７Phage感染的E.coli)修饰的T７DNA聚合酶(测序酶)DNA末端转移酶(小牛胸腺)反转录酶(依赖RNA)聚合酶第88页/共162页1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。2.主要区别T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。第89页/共162页高快有无TaqDNA聚合酶中低无无逆转录酶高快无无遗传修饰T7DNA聚合酶高快无高T7DNA聚合酶低中无高T4DNA聚合酶低中无低Klenowfragment低中有低大肠杆菌DNA聚合酶持续能力聚合速率5’®3’外切酶活性3’®5’外切酶活性DNA聚合酶3.常用DNA聚合酶的特性比较第90页/共162页三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大肠杆菌DNA聚合酶I主要用来制备带放射性标记的DNA探针。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质①一条单链多肽。②5’®3’外切酶活性位于N端。③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’®3’外切酶活性部分。就成为Klenowfragment。第91页/共162页①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③带有3’—OH游离端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反应条件-OH5’3’dNTPs第92页/共162页标记①核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制备探针已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交第93页/共162页标记已知序列的核酸片断②探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5’3’第94页/共162页③DNA聚合酶I对探针序列的标记切口转移法(nicktranslation)：放射性同位素标记：DNA聚合酶I同时具备5’®3’外切酶活性和5’®3’的聚合酶活性（以及3’®5’外切酶活性）。第95页/共162页5’®3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。切口切口5’5’3’3’5’3’5’3’第96页/共162页纯化的DNA片断DNaseI制造单链切口DNAPolI进行切口转移一种a-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记8第97页/共162页缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修复DNA的功能，用于大分子DNA标记（＞1000bp最好）；缺点：单链DNA、RNA不能用该法标记。第98页/共162页2.Klenowfragment(DNA聚合酶I大片段)

具有5’®3’聚合酶活性和3’®5’外切酶活性。（失去了5’®3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性质第99页/共162页C端76，000dKlenow活性５′→３′聚合３′→5′外切＋N端36，0005′→３′外切Jacobsen(1974),Joyce和Grindley,(1983)克隆此大片段。DNAPolI枯草杆菌蛋白酶第100页/共162页①3’端补平5’5’klenow②DNA3’末端标记补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途第101页/共162页3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种a-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHIa-32P-dATPa-32P-dGTP25oC1h第102页/共162页③cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物第103页/共162页随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。④随机引物法标探针第104页/共162页优点：(1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109cpm/μg探针缺点：不能标记环状DNA第105页/共162页纯化的DNA片断加热变性klenow进行5’-3’聚合反应随机引物，一种a-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP第106页/共162页（1）T4DNA聚合酶的性质3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有5’®3’聚合酶活性和3’®5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性第107页/共162页③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’®5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。第108页/共162页5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’第109页/共162页（2）T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用3’®5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’®3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。①补平隐蔽末端②DNA3’末端标记第110页/共162页酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’®5’外切）DNA酶切片断T4DNA聚合酶（5’®3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’内切酶切无dNTPs第111页/共162页4.T7DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：①T7基因5编码的大亚基：有5’®3’聚合酶和3’®5’外切酶活性。②大肠杆菌编码的小亚基：

硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。第112页/共162页（2）T7DNA聚合酶的特点①持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。②3’®5’外切酶活性高单链和双链都能降解。③不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍第113页/共162页②进行末端标记①以大分子量DNA为模板的合成如M13③补平隐蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法标记3’末端。与T4DNA聚合酶相同。合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。第114页/共162页5.修饰的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除3’®5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7DNA聚合酶的用途①DNA测序双脱氧法。②标记DNA3’隐蔽末端③更有效地补平末端第115页/共162页来源：是一种只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。结构：MW=60，000d.活性：①催化dNTP掺入DNA3′-OH末端，形成同聚物末端②反应不需模板DNA，需Co2+。用途：①克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。②末端标记6.末端转移酶(不依赖模板的DNA聚合酶)第116页/共162页商品反转录酶有两种①来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。②来自鼠类白血病病毒（MMLV）反转录酶。7.逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源第117页/共162页酶类别肽链5’-3’聚合活性RNaseHAMV2条：α：62000β：94000有强MMLV1条84000有弱RNaseH：以5’®3’或3’®5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。第118页/共162页合成长cDNAM-MLV优于AMV.RNaseHRNADNARNADNA第119页/共162页（3）逆转录酶的用途①合成cDNA以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA第120页/共162页

核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。核酸探针(Nucleicacidprobe)第121页/共162页1).按来源及性质划分

可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。

较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。

2).按标记物划分

有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。1.核酸探针的种类第122页/共162页放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。常用的同位素32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。1.放射性标记探针优点：灵敏度高，可以检测到pg级。

放射自显影效果好。缺点：半衰期短（32P只有14.3天）不易保存、对人体有害。要求在专门实验室操作。第123页/共162页2.非放射性标记探针i）生物素标记：生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素连接酶（biotinligase）催化与蛋白质共价结合。第124页/共162页纯化的DNA片断DNaseI制造单链缺口DNAPolI进行缺口转移生物素-dTTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中第125页/共162页光敏生物素标记生物素连接臂光敏基团探针序列探针序列生物素连接臂光敏基团+光照第126页/共162页在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forsteretal1985）。第127页/共162页抗生物素蛋白（avidin）：链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的识别——亲和素：是一种鸡卵清蛋白。细菌中avidin的类似物。能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：第128页/共162页ii）地高辛标记：可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒(kit)。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。第129页/共162页iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。酶的作用：第130页/共162页HRPO和AP的显色反应底物第131页/共162页碱性磷酸酶催化发光反应机理金刚烷第132页/共162页iv）用非放射性标记的探针检测原理生物素探针序列待测基因亲和素酶底物中间产物产物发光探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。第133页/共162页第134页/共162页一、T4多核苷酸激酶1.来源T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2.功能催化g磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否。第四节DNA修饰酶第135页/共162页5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的g磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。第136页/共162页3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(g-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’碱性磷酸酶（1）正向反应（forwardreaction）第137页/共162页（2）交换反应标记法反应混合物中具有超量(g-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(g-32P)ATP的g-32P与DNA5’端的磷酸交换。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(g-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反应效果不理想。第138页/共162页

二、碱性磷酸酶1.碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。SDS中加热68oC可完全失活。第139页/共162页2.碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH碱性磷酸酶3.碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体份子自我连接第140页/共162页单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A碱性磷酸酶5’5’5’第141页/共162页A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体3’OH连接。第142页/共162页aATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA第143页/共162页第五节RNA聚合酶1.RNA聚合酶①T7、T3RNA聚合酶在E.coli中的克隆表达。②T7、T3、RN