基因克隆基因剔除

基因克隆基因剔除第1页/共41页GeneofInterestGainofFunctionLossofFunction

第2页/共41页六、基因剔除技术（一）基因剔除技术的概念

基因剔除（geneknockout）或基因靶向(genetargeting)灭活是将生物体中某一特定的基因功能给破坏，再研究当生物体缺少这个基因在生长发育的过成中会有怎样的改变，或是会好发怎样的疾病。第3页/共41页原理：利用细胞复制分裂时，染色体进行联合互换发生同源重组homologousrecombination）Prdx1gene第4页/共41页EScell胚胎杂合子Prdx+/-纯合子Prdx-/-第5页/共41页Prdx1+/+:widetypemice(N=34)Prdx1+/-：Prdx1heteroxygousmice(N=88)Prdx1-/-：Prdx1knockoutmice(N=64)Sourthernblot-DNANothernblot-RNAGenerationofPrdx1-/-mice第6页/共41页进入多重防护的SPF动物室检查受精母鼠取胚胚显微注射第7页/共41页DNA显微注射显微注射完成胚植入输卵管养殖小鼠第8页/共41页动物饲养第9页/共41页（二）基因剔除技术的应用

★阐明特定基因功能、基因间相互作用★阐明基因结构与功能异常在疾病发生、演进和归转中的作用，即疾病分子调控机制★在精确的时间、组织打开或关闭特定基因★可对基因进行单个碱基或大片段的修饰★确定药物作用的分子靶点，有效筛选新药第10页/共41页ModelOrganismsUsedinFunctionalGenomics第11页/共41页MajorEventsintheDevelopmentofGeneTargeting第12页/共41页骨保护蛋白(Osteoprotegerin,OPG)+/+-/-转基因鼠基因剔除鼠骨硬化骨质疏松症第13页/共41页ProcedureofKnockoutMice第14页/共41页七、RNA干扰技术（一）RNA干扰技术的概念 生物体内，双链RNA(double-strandedRNA，

dsRNA)，能识别含有其互补序列的mRNA并与之结合，在酶的作用下降解mRNA，从而干扰相应基因表达。这一现象称为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)。 RNAi在生物抵御病毒感染、维持基因组中转座子的稳定以及某些生物生殖细胞的发育过程中都起着重要作用。第15页/共41页（细胞膜）（细胞核）（细胞质）基因的表达转录翻译（转运RNA）（核糖体RNA）第16页/共41页RNAi现象的发现

1995年，康奈尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA的确能够阻断par-1基因的表达，但是奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，也同样阻断了该基因的表达。

GuoS,KemphuesKJ.par-1,agenerequiredforestablishingpolarityinC.elegansembryos,encodesaputativeSer/Thrkinasethatisasymmetricallydistributed.Cell.1995;81(4):611-20.

SectionofGeneticsandDevelopment,CornellUniversity,Ithaca,NewYork14853,USA.第17页/共41页基因沉默，即性状不表现外源导入或者转基因表达反义RNA，抑制rRNA和tRNA的翻译。第18页/共41页

Fire等(1998)发现将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达,并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又称转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)。该课题组将这一现象称为RNA干扰（RNAinterference，简称RNAi）。FireA,etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinC.elegans.Nature.1998;391(6669):806-11.第19页/共41页（二）RNA干扰技术的原理（3步骤）dsRNA的形成

siRNA的形成

RNAi的形成

第20页/共41页靶基因mRNAsiRNA的反义链RNAi是生物体抵御外源遗传物质入侵的自我保护机制。mRNA被酶切破坏，性状无法表达。第21页/共41页dsRNA：外源或内生，或病毒或其他双链RNA；或异常RNA由RdRP催化合成双链RNAsiRNADicer核酸酶特异性蛋白结合，siRNA解链活化的siRNA复合体(RISC)靶基因的mRNAsiRNADicer核酸酶核酸酶降解mRNARdRP催化合成新的双链RNA（dsRNA）以反义siRNA为引物3’5’5’5’3’3’5’随机降解性聚合酶链式反应（randomdegradativePCR）

第22页/共41页InitiationStepATPATPADP+ppiADP+ppiDICERKINASERdRP第23页/共41页EffectorStepsiRNAbindingsiRNAunwindingRISCactivation第24页/共41页Dicer第25页/共41页siRNA5’3’5’3’第26页/共41页RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的组成2RNAbindingproteinsRNA/DNAHelicaseTranslationInitiationFactorRNA-DependentRNAPolymerase(RdRP)TransmembraneProtein第27页/共41页VectorsexpressingsiRNAsU6H1siRNA第28页/共41页VectorsexpressingsiRNAsU6SensesequenceAnti-sensesequenceHair-pinloopSensesequenceAnti-sensesequence第29页/共41页（二）RNA干扰技术的应用1．用于功能基因组分析

随着人类基因组计划的完成，科学家急需一种新的、快速的方法解读基因功能、基因表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi技术已成为解决这些问题的重要手段。

第30页/共41页 RNAi可以高通量分析植物的全基因组基因。 在水稻和拟南芥的基因组测序完成后，人们获得了众多的候选基因，RNAi为注释和认识这些基因在植物体中所起的作用提供了一种快速、高效的鉴定方法。第31页/共41页2．用于生物遗传改良

随着生活水平的提高，人们对植物产品品质的要求也日益提高。例如油料产品中的硫甙含量、不饱和脂肪酸的含量，咖啡中的咖啡因的含量等。而传统育种很难同时改变作物多个品质性状。 人们对一些生化物质代谢途径的认识使得分子改良成为可能。第32页/共41页 RNAi的功能之一是保护基因组不被可移动的基因元件如转座子或病毒RNA的侵犯，RNAi效应为植物中利用siRNA抗病毒提供了广阔的前景。 以靶mRNA为模板的PCR模式尤其适用于抗变异病毒：只需要根据病毒保守的序列设计siRNA，就可抑制所有的变异病毒。第33页/共41页3．用于基因治疗

RNAi可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。在治疗病毒性疾病的研究中，可以设计针对病毒基因组RNA的siRNA或针对宿主细胞病毒受体的siRNA来抗病毒。 针对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、呼吸道合胞体病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、HIV-1、SARS等均取得了令人欣喜的体外病毒抑制作用。第34页/共41页

2003年爆发的非典型肺炎给人类健康带来极大的危害，引起全球关注。

2005年，中美科学家根据RNA干扰的原理研制出了一种可有效抑制SARS的新疗法：利用小型RNA片段阻碍基因的表达，即RNA干扰(RNAi)。第35页/共41页冠状病毒基本结构

SARS病毒核心为螺旋状排列的RNA及衣壳（N蛋白）组成的核壳体，其外为包膜。N蛋白是SARS病毒重要结构蛋白，在病毒转录、复制和成熟中起作用。病毒包膜S蛋白的功能是与细胞受体结合，使细胞发生融合，是SARS冠状病毒侵染细胞的关键蛋白。第36页/共41页乙肝病毒的结构针对乙肝病毒的RNAi技术可能治疗乙肝第37页/共41页RNAi用于肿瘤的治疗生存素(survivin)在细胞凋亡和周期调控中发挥重要作用。许多恶性肿瘤的生存素基因表达增高，而正常组织无表达。第38页/共41页赵伟红，郭俊明，等.生存素siRNA表达质粒对MGC-803细胞细胞周期和增殖的影响.世界华人消化杂志，2005，13：2302-2305空白对照转染试剂