小鼠皮肤光老化动物模型建立方法的改良

小鼠皮肤光考化动物模型建立方法的改良李张军;牛新武消生祥;KhanAbidullah浏彦婷;马慧群;彭振辉【摘要】目的改良小鼠皮肤光老化动物模型的建立方法，为临床防治皮肤光老化打下基础.方法设计制作一种构建小鼠皮肤光老化动物模型的装置，利用装置中紫外线(UVA315-400nm;UVB280~315nm)照射ICR小鼠,3次/周,共12周，累计照射剂量:UVA为151.20J/cm2,UVB为22.68J/cm2;观察照射部位皮肤的临床表现、组织病理及超微结构的改变情况，测定皮肤中羟脯氨酸含量.结果与正常对照组小鼠皮肤比较，模型组皮肤出现粗糙增厚、弹性丧失、粗深皱纹、毛细血管扩张、脱屑及皮革样外观;组织病理可见表皮不规则增厚，真皮胶原纤维变性，断裂减少，排列紊乱,分布不均;超微结构显示胶原纤维排列紊乱，分布不均，周期性横纹不清,横断面胶原纤维直径增大，粗细不等;皮肤中羟脯氨酸含量显著减少(P<0.01).提示造模成功.结论利用改良的自制造模装置建立ICR小鼠皮肤光老化动物模型是一种简便易行、经济实用、可复性强的方法.【期刊名称】《西安交通大学学报(医学版)》【年(卷)，期】2016(037)001【总页数】5页(P144-147,156)【关键词】小鼠;皮肤;光老化;动物模型;方法改良【作者】李张军;牛新武消生祥;KhanAbidullah浏彦婷;马慧群;彭振辉【作者单位】西安交通大学第二附属医院皮肤科,陕西西安710004;西安交通大学第二附属医院皮肤科，陕西西安710004;西安交通大学第二附属医院皮肤科，陕西西安710004;西安交通大学第一附属医院烧伤整形科，陕西西安710061;西安交通大学第二附属医院皮肤科，陕西西安710004；西安交通大学第二附属医院皮肤科膜西西安710004;西安交通大学第二附属医院皮肤科膜西西安710004【正文语种】中文【中图分类】R751光老化导致皮肤过早出现粗糙、深乱皱纹、色素异常、脆性增加、毛细血管扩张及皮革样外观等损美性症状，严重影响人们的夕卜表［1］。随着审美标准的不断提高，人们对皮肤光老化的防治越来越重视。光老化动物模型是研究光老化发病机制和筛选防治皮肤光老化药物的重要媒介。因此，建立一种模拟性强、操作简便和评价指标明确的光老化动物模型一直是研究热点［2］,相关报道也很多，但主要采用紫外线光疗仪和自制的紫外线灯箱长期反复照射无毛小鼠进行造模［3-6］,其成本高昂，小鼠易脱水死亡，应用受限。本研究对造模方法作了一些改良，首先设计制作一种构建小鼠皮肤光老化动物模型的装置，然后利用装置的中长波紫外线照射匕日小鼠背部皮肤建立皮肤光老化动物模型。1.1实验动物健康雄性ICR小鼠20只，体质量（24±2）g，由西安交通大学基础医学院实验动物中心提供，常规饲食饮水，无不良因素影响，生活环境相对稳定［温度（23±2洗、湿度（55±5）%、12h昼夜交替］。1.2主要仪器及试剂自制的一种构建小鼠皮肤光老化动物模型装置（图1）；40W长波紫外线（UVA）灯管2支，发射光谱315-400nm,峰值365nm,40W中波紫外线（UVB）灯管4支，发射光谱280-315nm，峰值312nm（北京电光源研究所）;UVA和UVB型紫外线辐照计（上海希格玛高技术有限公司）；H-600透射式电子显微镜（日本日立公司）；羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。1.3紫外线照射将20只雄性ICR小鼠随机分为正常对照组和模型组，每组10只，用电动剃毛刀剃除约3cmx3cm面积小鼠背部毛发，以后每次照射前均剃毛。调整造模装置的小鼠箱高度，使灯管距离背部皮肤30cm。小鼠适应性喂养1周，自第2周开始照射模型组，3次/周(周一、周三、周五)，每次照射前灯管预热15min,第2~4周每次照射时间分别为20、40、60min,自第5周开始每次80min，共照射12周(UVA辐照强度累计为151.20J/cm2,UVB辐照强度累计为22.68J/cm2)。1.4组织取材及标本制备照射12周后用40g/L硫化钠给小鼠背部脱毛，100g/L水合氯醛(400mg/kg)腹腔麻醉，立即切取背部皮肤组织在冰生理盐水中漂洗，去除血液，滤纸拭干后分成3份，一份标本经100mL/L中性甲醛固定，石蜡包埋，切片(5pm)进行常规HE染色、胶原纤维MASSON染色，用于普通光学显微镜观察；一份切成1mm3的小方块，经25g/L戊二醛及10g/L四氧化饿双固定，环氧树脂Epon812包埋，切超薄片(70nm)进行醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，用于透射电镜观察；剩余标本立即置液氮中速冻，然后放入-80°C冰箱中冻存，用于检测皮肤羟脯氨酸含量。光镜下每个MASSON染色切片随机选取5个区域(x200),应用Image-ProPlus6.0图像分析系统计算胶原纤维面积占皮肤总面积的百分比。1.5小鼠皮肤羟脯氨酸含量的测定取小鼠皮肤组织50mg，严格按照相应试剂盒说明操作，采用碱水解法检测皮肤组织中羟脯氨酸的含量。1.6统计学方法采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。所有数据均以均数标准差表示，组间差异性比较采用独立样本的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。2.1构建小鼠皮肤光老化动物模型的装置该装置包括照射箱和小鼠箱；其中，照射箱内侧的顶部安装有6支紫外线灯管（2支UVA灯管+4支UVB灯管）；照射箱的两个相邻侧壁上设置有通风孔，与其中一个通风孔相对的侧壁上设置有电源开关组和排气扇，电源开关组中的一个电源开关用于控制排气扇，其余电源开关用于控制6支紫外线灯管；照射箱上设置有箱门，其与设置有电源开关组的侧壁相邻，箱门设置有透明观察孔和把手，其上端活动铰接于照射箱的顶部；小鼠箱为具有六面体的箱体，其侧壁由透明材料制成，其顶部设置有网栅，网栅一端活动铰接于小鼠箱的侧壁上，另一端通过搭扣锁定；小鼠箱侧壁上设置有饮水器，其底部设置有高度可调解的支撑脚；使用时，将小鼠箱放置在照射箱内（图1）。2.2肉眼观察正常对照组小鼠背部皮肤色泽正常、光滑、弹性好；模型组皮肤出现粗糙增厚、弹性丧失、粗深皱纹、毛细血管扩张、脱屑及皮革样外观等光老化改变（图2）。2.3组织病理学改变正常对照组表皮正常、结构完整，真皮胶原纤维呈波浪状排列，整齐有序，分布均匀，血管正常，细胞成分及数量适中；模型组表皮不规则增厚，真皮胶原纤维变性，排列紊乱，胶原束增粗、卷曲、断裂、疏密分布不均，可见毛细血管扩张，附属器增生，炎性细胞浸润（图3）。2.4胶原纤维Masson染色正常对照组胶原纤维呈波浪状紧密排列，整齐有序，分布均匀；模型组胶原纤维变性，含量减少，排列紊乱，疏密分布不均（图4）。Image-ProPlus6.0图像分析系统对胶原纤维面积占皮肤总面积比值进行测定，结果表明，与正常对照组比较，模型组皮肤胶原纤维相对含量减少（P<0.01，图5）。2.5透射电镜下皮肤中胶原纤维的变化正常对照组胶原纤维分布均匀，可见周期性横纹，横断面胶原纤维直径大小相等、均匀分布；模型组胶原纤维排列紊乱，分布不均，周期性横纹不清，横断面胶原纤维直径增大，粗细不等(图6)。2.6小鼠皮肤羟脯氨酸含量的变化与正常对照组(2.64±0.57川g/mg比较，模型组小鼠皮肤羟脯氨酸含量显著减少［(1.83±0.49)|jg/mg］(P<0.01,n=10)。皮肤老化包括时程老化和光老化，前者是由遗传学控制下不可逆的自然生理过程，后者是由慢性紫外线暴露所致的皮肤老化［7］。光老化动物模型是医学研究的重要实验模型，对研究皮肤光老化发病机制和治疗光老化疾病有着重要意义。然而，国内外卜皮肤光老化动物模型的造模方法及检验模型的成功与否仍没有统一标准［2］。当前科研工作者主要以无毛小鼠为动物模型，可以避免造模时反复脱毛，这类动物经紫外线反复照射后引起真皮结缔组织的改变非常类似于人光老化皮肤［3-4］。但是，无毛小鼠价格昂贵，国内数量少，限制了其应用。本实验选择最常用的ICR小鼠作为实验动物，价格低廉，适用性广，且通过适当的方法造模后，出现了典型的皮肤光老化特征。目前，缺乏专门用于构建小鼠皮肤光老化动物模型的设备。国内外卜文献报道，构建皮肤光老化动物模型主要通过紫外线光疗仪和自制的紫外线灯箱产生紫外线，然后利用紫外线长期反复照射小鼠［4-6］。但是，紫外线光疗仪因实验设计中对紫外线波长的不同要求而应用受限，且价格昂贵，一般实验者因经费有限购置的可能性不大；自制的紫外线灯箱标准不统一，照射时间过长，大量产热，易造成小鼠脱水死亡。因此，我们设计制作了一种构建小鼠皮肤光老化动物模型的装置，为光老化动物实验提供借鉴。与现有的技术设备相比，该装置使用方便，成本低廉，可满足多只小鼠同时造模；照射箱设有通风孔和排气扇，小鼠箱设有饮水器，能改善箱内的空气质量和温度，满足小鼠饮水，从而降低小鼠死亡率；可通过调整紫外线灯管的类型和数量，配合电源开关组，实现对紫外线波长及照射强度的调节，来满足不同实验设计对照光的要求；小鼠箱设有高度可调节的支撑脚，能满足实验设计对照光距离的不同要求。太阳光中到达地球表面的紫外线主要是长波紫外线(UVA315-400nm,95%)和中波紫外线(UVB280~315nm,4%~5%)[8]。UVB穿透力弱，大部分被表皮所吸收，但阶能较高；UVA能穿透表皮深达真皮、皮下组织，但其阶能低，发挥效应所需的剂量较UVB大1000倍[9]。研究发现，UVA和UVB照射皮肤可产生活性氧/活性氮(ROS/RNS)，损伤DNA，影响多种细胞通路和基因表达，最终导致皮肤炎症、光老化和皮肤癌[9-10]。因此，本实验采用UVA和UVB联合照光。皮肤光老化最具特征性的组织病理表现是胶原纤维变性紊乱、含量减少和异常弹性纤维沉积[11-12]。与正常对照组小鼠皮肤相比，模型组表皮不规则增厚，真皮胶原纤维变性，断裂减少，排列紊乱，分布不均。超微结构显示模型组胶原纤维排列紊乱，分布不均，周期性横纹不清，横断面胶原纤维直径增大，粗细不等。羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸，测定它的含量可以间接反映皮肤中胶原蛋白含量的变化。本研究发现模型组羟脯氨酸含量显著减少，提示模型组皮肤胶原蛋白含量减少。这些改变均为皮肤光老化的典型特征，结合肉目艮观察可确证造模成功。综上所述，本研究通过对造模方法进行适当改良，利用自制的构建小鼠皮肤光老化模型装置，成功建立了ICR小鼠皮肤光老化动物模型，为临床开展光老化的防治研究提供一种简便易行、经济实用、可复性强的造模方法。【相关文献】HELFRICHYR,SACHSDL,VOORHEESJJ.Overviewofskinagingandphotoaging[J].DermatolNurs,2008,20(3):177-183.杨汝斌，万屏，刘玲，等.SD大鼠皮肤光老化动物模型建立方法的探索[J].中国皮肤性病学杂志,2011,25(3):199-202.BHATTACHARYYATK,PATHRIAM,MATHISONC,etal.CosmeceuticaleffectonskinsurfaceprofilesandepidermisinUV-B-irradiatedmice[J].JAMAFacialPlastSurg,2014,16(4):253-260.LIMJY,KIMOK,LEEJ,etal.ProtectiveeffectofthestandardizedgreenteaseedextractonUVB-inducedskinphotoaginginhairlessmice[J].NutrResPract,2014,8^4):398-403.IMAR,SONGJH,LEEMY,etal.Anti-wrinkleeffectsoffermentedandnon-fermentedCyclopiaintermediainhairlessmice[J].BMCComplementAlternMed,2014,14:424.金晓哲，吴景东，闫海慧.针刺足三里对小鼠皮肤光老化的影响[J].中国美容医学,2010,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