SL核酸的生物合成DNA的复制

SL核酸的生物合成DNA的复制第1页/共97页问:1.亲代是如何把遗传信息传递给子代的？2.DNA上的遗传信息是如何转录到RNA上的？3.mRNA上所带信息是如何翻译成蛋白质的？第2页/共97页.核酸的生物合成

14.1DNA的生物合成

14.2RNA的生物合成15.蛋白质的生物合成16.基因表达调控讲解内容第3页/共97页14.1DNA的生物合成(重点)14.2RNA的生物合成(重点)14.3核酸合成抑制剂（自学）14.4基因工程简介（自学）14核酸的生物合成第4页/共97页14.1DNA的生物合成14.1.1DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）14.1.2逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成）14.1.3DNA的损伤、修复与突变第5页/共97页Watson&Crick:

一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的突变控制性状的表达第6页/共97页14.1.1DNA的复制一、复制的基本规律二、DNA聚合反应有关的酶类三、原核细胞DNA的复制过程四、DNA复制的忠实性五、真核细胞DNA的复制第7页/共97页一、复制的基本规律复制（replication）?

以亲代DNA分子的双链为模板，按照碱基互补配对原则，合成出与亲代DNA分子完全相同的2个双链DNA分子的过程。第8页/共97页DNA复制的基本规律方式：半保留复制(semi-conservativereplication)方向：双向复制(bidirectionalreplication)特点：半不连续复制

(semi-discontinuousreplication)

高保真性(highfidelity)第9页/共97页DNA复制可能的三种方式第10页/共97页(一）半保留复制的实验依据和意义什么叫半保留复制？

DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。第11页/共97页AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+亲代DNA

复制叉子代DNADNA的半保留复制第12页/共97页由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验TestingModelsforDNAreplication第13页/共97页Meselson和Stahl证明DNA半保留复制的实验流程（1958）-同位素示踪实验第14页/共97页第15页/共97页Meselson和Stahl的实验结果第16页/共97页TheReplicationofDNAinEschrichiacoli.MatthewMeselsonFranklinStahl

ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA.1958,44:671-682《美国自然科学研究院学报》1958，44：671－682第17页/共97页MatthewMeselsonandFranklinStahlmorerecentlyFacultymemberatHarvardMechanismsofMolecularEvolutionFacultymemberatU.ofOregonMeioticRecombination第18页/共97页半保留复制的生物学意义按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。第19页/共97页（二）双向性原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。

复制中的放射自显影图象第20页/共97页复制叉的结构当DNA复制从起始区起动的时候，起始区的DNA双链因发生解链而形成叉状结构，这样的结构被称为复制叉

第21页/共97页（三）、复制的半不连续性3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)

冈崎片段（Okazakifragment）第22页/共97页二、参与大肠杆菌DNA复制的酶类复制过程参加物质原料：dNTP条件：供能ATPMg2+模板：DNA酶引物体内：RNA体外：DNA单链结合蛋白等

过程：DNA复制是多种蛋白质和酶参与的复杂过程。DNA聚合酶引物酶解螺旋酶连接酶拓扑异构酶第23页/共97页两个特点：DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3方向进行。第24页/共97页（一）DNA聚合酶（DNApolymerase）简称：DNA-polⅠⅡⅢ种类：原核α

β

γ

δ

ε真核第25页/共97页DNA聚合酶(DNA-pol)这类酶的共同性质:1.以脱氧核苷三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;2.需要模板，按碱基互补原则合成子链;3.需要引物，不能起始合成新的DNA链;催化dNTP加到生长中的DNA链的3’-OH末端;4.催化DNA合成的方向是5’→3’；第26页/共97页模板；引物；dNTP；合成方向；反应可逆；Mg2+；DNA-pol作用：催化两个dNTP生成磷酸二酯键反应：53

的聚合活性指出：DNA-pol还具有核酸外切酶活性第27页/共97页5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´

35外切酶活性

53外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。

核酸外切酶活性

第28页/共97页第29页/共97页ArthurKornberg(1958)大肠杆菌细胞蛋白质提取物+DNA模板有无DNA合成??-dNTPs-Mg2+(辅助因子)-ATP(能源)-游离的3’OH端(引物)体外测定DNA复制纯化得到DNA聚合酶I

StanfordUniversity

Stanford,CA,USA

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959（揭示人类DNA合成机制）第30页/共97页DNApolⅠ：作用：1.对复制中的错误进行校读和切除；

2.填补复制和修复过程中出现的空隙；DNA大片段：核苷酸聚合枯草杆菌Pr酶（Mw7.6万）(KlenewFrament)小片段：5’－3’外切（Mw3.4万）

PolⅠ第31页/共97页DNA-polⅠ（109kD）A－P为18个－螺旋区，H和I之间由较大的非螺旋区连接。第32页/共97页小片段

大片段（Klenowfragment）5’→3’聚合功能，3'→5'外切酶活性5'→3'外切酶活性DNApolIEJPNMLHIORQGCDBFAK第33页/共97页DNApolII1970年分离得到；聚合酶活性：2400base/min；100分子/cell；有3’→5’核酸外切酶活性，没有5’→3’核酸外切酶活性；在DNArepair

中起作用；第34页/共97页DNApolIII“真正”的大肠杆菌DNA复制酶快：1000nt/秒/酶

酶量合适精确其结构十分复杂!!!第35页/共97页

E.coliDNA聚合酶Ⅲ不对称二聚体ε''ε第36页/共97页十种亚基（αβγθτδδ’χΨε）组成的不对称二聚体。Αεθ组成核心酶，β2称为夹子，（γ2δδ’χΨ）组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。DNA-polⅢ(250kD)第37页/共97页DNA聚合酶III全酶的滑动钳夹住双螺旋DNA

第38页/共97页原核生物的三种DNA聚合酶性质比较表

种类PolⅠⅡⅢ

作用

修复（10/秒）修复（0.5/秒）复制（150/秒,10万/分）活性2＋＋3＋功能催化两个dNTP聚合生成3’,5’-磷酸二酯键Mw/×103102880830外切3’－5’

＋＋＋外切5’－3’

＋－＋分子数/细胞40010020（活性比Ⅰ大20倍）第39页/共97页真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶催化活性功能5'→3'

聚合3'→5'

核酸外切5'→3'

核酸外切真

核

生

物DNA聚合酶a＋切去引物RNA，补上正确的DNA片段DNA聚合酶b

＋DNA聚合酶g

＋负责链的延长DNA聚合酶d＋＋负责先导链的延长

第40页/共97页（二）引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶是一种特殊的RNA聚合酶

该酶以DNA为模板，合成一段RNA引物。DNA复制在该引物上加入dNTP。第41页/共97页RNA聚合酶DNA模板RNA引物NTPPrimase（引物酶）答：因为DNApol不能催化两个游离的dNTP聚合。问：为什么引物不可以是DNA？第42页/共97页第43页/共97页（三）DNA连接酶(DNAligase)催化DNA双链中一条链上的缺口（3′-OH与它下游相邻的核苷酸的5′-磷酸之间）共价连结（形成磷酸二酯键）。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。第44页/共97页（四）解旋酶(helicase)作用：—利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链.大肠杆菌DnaB蛋白的解旋酶活性

第45页/共97页（五）单链DNA结合蛋白（singlestrandedbindingprotein，SSB）作用：防止单链DNA重新形成双链， 防止单链DNA被核酸酶水解。特点：四聚体，DNA跨度32bp,呈协同效应，不断的结合和解离。第46页/共97页第47页/共97页（六）DNA拓扑异构酶

(DNAtopoisomerase)

已知：在生物体内，DNA以超螺旋的形式存在。问：复制时，超螺旋时如何打开的？——拓扑异构酶起着重要的作用复制时，DNA解链沿中心轴反向旋转，因为复制速度快，旋转也快（100次/秒），易导致DNA出现：打结、缠绕和连环。第48页/共97页第49页/共97页DNA复制过程中形成的正超螺旋

第50页/共97页拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键分类拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ第51页/共97页第52页/共97页

三、原核细胞的DNA复制过程（一）.复制的起始（Initiation）（二）.复制的延伸（Elongation）（三）.复制的终止（Termination）第53页/共97页（一）、复制的起始解决两个问题1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。第54页/共97页（一）复制的起始1、DNA解成单链

由特定蛋白质识别复制起始位点（ori），在解螺旋酶、TOPO异构酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉。倒Y第55页/共97页双向复制单向复制第56页/共97页第57页/共97页DnaADnaBDNA拓扑异构酶引物酶SSB35352.引发体和引物的生成含有解旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体。（解旋酶）DnaC第58页/共97页3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶原核（50-100bp），真核（10bp）合成引物第59页/共97页大肠杆菌复制起始模型第60页/共97页（二）DNA链的合成与延伸

引物合成后，由DNApolⅢ（在真核细胞为DNApol和)催化，按碱基配对原则，将dNMP逐一添加到引物3’

末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长。3’——AAGACCTATT——5’5’——TTCTGGATAA——3’35/62第61页/共97页5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol第62页/共97页DNA链的延伸

在DNApolШ的催化下，以四种dNTP为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上dNTP并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和后随链的合成。两条链方向相反。5’3’5’3’DirectionofunwindingContinuousreplication5’3’PrimerPrimer5’3’Primer5’3’Discontinuousreplication第63页/共97页DNAreplicationissemi-discontinuous前导链后随链第64页/共97页DNA的半不连续复制：Okazakis(1968)；ReijiOkazaki

wasbornnearHiroshima,Japan,in1930.HewasateenagerthereatthetimeoftheexplosionofthefirstoftwonuclearbombsthattheUSdroppedattheendofWorldWarII.Hisscientificcareerwascutshortbyhisuntimelydeathfromcancerin1975attheageof44,perhapsrelatedtohisexposuretothefalloutofthatblast.semi-discontinuous第65页/共97页在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或后随链。

第66页/共97页冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:DNA聚合酶I（

53外切酶的功能）DNA连接酶第67页/共97页（三）复制的终止原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。第68页/共97页子代DNA的分离

第69页/共97页四、DNA复制的精确性（高保真复制）

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下几点:1、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为710-6

）2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。3、起始时以RNA作为引物。4、DNA的损伤修复系统。第70页/共97页DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配碱基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸第71页/共97页复制过程小结7.DNA聚合酶I切除引物；填补空隙；8.连接酶连接。1.DnaA识别并结合于复制起始点（Ori），促使局部解链。2.DnaB在DnaC协助下结合并沿链方向移动置换出DnaA，形成复制叉。3.SSB结合于解开的DNA单链。4.形成引发体（DnaB，DnaC，引物酶和局部DNA）。

ATP供能下合成RNA引物。5.Topo异构酶解除打结及缠绕，形成利于复制的负超螺旋。6.DNA聚合酶Ⅲ沿5’→3’方向合成新链。半不连续复制。领头链；随从链形成冈崎片段。直至Termination而终止。第72页/共97页五、真核细胞的DNA复制

（一）复制的起始（二）复制的延长（三）复制的终止染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙该如何填补？自学内容注意：原核生物E.Coli

的DNA是环状双链；真核生物为线状双链DNA。已知：DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合，而且DNA单链的母链还易被DNase水解。第73页/共97页53355335问：线性DNA分子如何避免每复制一次末端就缩短一次？533+3355第74页/共97页真核生物的端粒和端粒酶真核生物DNA末端结构是端粒，在端粒酶的作用下形成。（TTAGGG）n(telomereandtelomerase)第75页/共97页端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…第76页/共97页端粒酶(telomerase)

端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶第77页/共97页端粒酶的作用机理

第78页/共97页14.1.2逆转录

以RNA为模板，dNTP为原料，按碱基配对规律合成DNA的过程称之。由逆转录酶催化。逆转录（reversetranscription

）

:逆转录酶（reversetranscriptase）RNADNA

逆转录酶第79页/共97页逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板逆转录酶DNA-RNA

杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA第80页/共97页逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。

试管内合成cDNAcDNAcomplementaryDNA第81页/共97页

逆转录研究的意义

逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

第82页/共97页14.1.3DNA损伤、修复和突变DNADamage,RepairandMutation第83页/共97页14.1.3.1DNA的损伤与修复

某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤。DNA的修复主要有以下类型:暗修复四、诱导修复（SOS修复）一、光裂合酶修复二、切除修复三、重组修复第84页/共97页第85页/共97页DNA损伤的修复DNA紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于损伤部位3、酶被可见光激活4、修复后酶被释放