玻璃化冷冻及质控-ZXY

/玻璃化冷冻技术卵母细胞的玻璃化冷冻及复苏【适应症】取卵日丈夫精液和／或睾丸组织中未见可用精子，建议冻存全部卵母细胞;若精子质量极差，可疑受精困难,向患者充分交待病情,知情同意的原则下可考虑冻存部分卵母细胞;取卵日患者获卵数>20，自愿冻存部分卵母细胞留待捐赠或自用丈夫患有某些疾患(如梅毒、丙肝潜伏期或感染期、携带者）不适宜冷冻胚胎者,如获卵数〉1２,建议冷冻部分卵母细胞【冷冻操作流程】1｝签署卵母细胞冷冻知情同意书2}将玻璃化冷冻液置于室温下30分钟后使用，同时准备好冷冻载体、支架,标记清楚；３）将待冷冻的卵母细胞脱颗粒细胞,尽量剥除干净4)室温下将２—4枚成熟卵母细胞置于冷冻液１中3－5分钟，然后迅速转移至冷冻液2,在1分钟内将卵母细胞置于冷冻载体上，迅速浸入液氮,装管，保存。【复苏操作流程】核对卵母细胞冷冻保存知情同意书，如为捐赠卵母细胞,必须具有赠卵知情同意书；将玻璃化冷冻复苏液置于室温下，30分钟后使用；按照冷冻卡片找到胚胎在液氮罐中的位置，取出冷冻管放入装有液氮的保温桶内。确认标本无误;将冷冻载杆从外套管中取出，将其前端（装有卵母细胞）浸于wａrｍing液中，显微镜下寻找卵母细胞,找到后迅速转入Ｔ1液中，室温放置3分钟,再依次转入T2，ｗａshing液中各3分钟,挪入事先准备好的培养滴;3h后行ＩCSI囊胚的玻璃化冷冻及复苏【冷冻标准】D5或D６,3BB以上囊胚【冷冻操作流程】1｝将囊胚玻璃化冷冻液置于37℃2）37℃下将１—2枚囊胚置于冷冻液1中2分钟,然后迅速转移至冷冻液2,在30秒内将【复苏操作流程】核对囊胚冷冻保存知情同意书；将玻璃化冷冻复苏液置于3７按照冷冻卡片找到胚胎在液氮罐中的位置，取出冷冻管放入装有液氮的保温桶内.确认标本无误;将冷冻载杆从外套管中取出，将其前端（装有囊胚）浸于Ｔ１液中,显微镜下寻找囊胚,37℃放置２分钟，再依次转入T23分钟，washing液中5分钟,2h后观察囊胚扩张情况，评价损伤及移植价值。如2h后仍未扩张建议培养24h再观察，如仍未扩张，放弃移植。ﻬ实验室质控进入实验室后检查记录实验室温度（21-25℃)、湿度（40—６０％）、检查层流开启状态及培养箱一般情况（温度３7、ＣO2显示值５—每日工作结束后必须检查，填写每周用CO2检测仪检测、核对培养箱CO２浓度(标准?）；核对并记录培养箱温度；二周一次对培养箱进行定期消毒,每批次的培养液及耗材必须有到货时间、使用时间记录,新批次培养液必须检测行血气分析；新耗材、培养箱、培养液必须经过精子生存实验５。精子生存实验

用上游法分离活动性良好的精子。调整活精浓度5-２0×109/L;取0。5ml精子混悬液，置入5ml培养管或培养皿内,做为实验管，取0.5ml精子混悬液置另一个培养管及培养皿内，做为阴性对照管;将待检测的各种耗材置于试验管(皿）内,室温下放置4天后，用Ｍａｋlｅr计数器或红血球计数器计数试验管及对照管内的活动精子，并计算它们之间的生存指数.生存指数=试验管内活精/对照管内活精×１0０％如果生存指数小于7５％，就应考虑可能有细胞毒素的存在。注意：1）４天后阴性对照管精子存活率应大于5０％；2）实验时可设立阳性对照，即在精子混悬液中加入橡胶手套碎片，培养4天后精子应全部死亡；3）只有阴性对照、阳性对照结果均正常情况下,试验结果方有效，生存指数〉75％方可通过；4)如果一次精子生存实验未通过,应再次重复,３次实验中至少2次通过方可使用；6。定期检测实验室压差,更换滤膜(初效：1－２月；中效：2－４月；亚高效:1年；高效:3年)7.实验室新来人员培训：所有培训应有记录，在带教老师指导下操作?例后,经过实验室考