抗体制药医学知识专家讲座

抗体是指能与对应抗原特异性结合含有免疫功效球蛋白。

抗体产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌球蛋白。抗体制药医学知识专家讲座第1页20世纪60年代发觉多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化学结构概念，而抗体是生物学功效概念。抗体制药医学知识专家讲座第2页

多克隆抗体：病原微生物含有各种抗原决定簇抗原物质，所以这些抗体制剂也是各种抗体混合物，故称多克隆抗体。抗体制药医学知识专家讲座第3页1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibodyMcAb）。单克隆抗体含有高度特异性、均一性、起源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新伎俩，还促进了基础和临床医学发展。抗体制药医学知识专家讲座第4页

单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病诊疗和治疗。单克隆抗体检测与一些疾病相关抗原，辅助临床诊疗。用放射性核素标识单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊疗。抗体制药医学知识专家讲座第5页

单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。以单克隆抗体作为载体药品对肿瘤进行定向治疗。抗体制药医学知识专家讲座第6页第二节单克隆抗体

单克隆抗体是将抗体产生细胞与含有没有限增殖能力骨髓瘤细胞相融合，经过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一单克隆细胞系而产生。抗体制药医学知识专家讲座第7页抗体制药医学知识专家讲座第8页抗体制药医学知识专家讲座第9页

一、抗原与动物免疫制备特定抗原单克隆抗体，首先要制备用于免疫适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有抗原能够用化学合成：地高辛多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。抗体制药医学知识专家讲座第10页

为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。当前惯用骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠，所以免疫动物也采取对应品系。抗体制药医学知识专家讲座第11页

免疫方法采取体内免疫法和体外免疫法。

体内免疫法适合用于免疫原性强、抗原量较多时应用，普通用8～12周龄雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进行首次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。7抗体制药医学知识专家讲座第12页可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行首次免疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。普通再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。抗体制药医学知识专家讲座第13页

脾内免疫法即在麻醉下直接将

0.1～0.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10μg。

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体外免疫法用于不能采取体内免疫情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引发免疫抑制。优点：需抗源量少，免疫期短，干扰原因少。抗体制药医学知识专家讲座第15页

体外免疫法：用4～8周龄BALB/c

小鼠脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5μg/ml,在5%CO

37C下培养4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。o2o抗体制药医学知识专家讲座第16页二、细胞融合与杂交瘤细胞选择性培养细胞融合方法：脾细胞（1×10）骨髓瘤细胞（2×10）混合聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液迟缓稀释。87抗体制药医学知识专家讲座第17页

用于细胞融合骨髓瘤细胞应含有融合率高，本身不分泌抗体，所产生杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长久稳定。

PEG相对分子量4000，浓度为50%

二甲基亚砜增加融合率。抗体制药医学知识专家讲座第18页

细胞融合后可产生各种融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合细胞。选择性培养:

培养基为HAT培养液。次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。

A阻断DNA合成。抗体制药医学知识专家讲座第19页抗体制药医学知识专家讲座第20页

三、筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆惯用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。克隆化是指单个细胞经过无性繁殖而取得细胞集团整个培养过程。抗体制药医学知识专家讲座第21页ELISA用于破伤风抗体筛选抗体制药医学知识专家讲座第22页四、杂交瘤细胞与抗体性状判定杂交瘤细胞判定：染色体分析。它是判定客观指标，了解分泌抗体能力。单抗进行Ig类和亚类判定：用羊或兔抗Ig不一样类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA判定。亲和力、特异性、纯度、分子量测定。抗体制药医学知识专家讲座第23页五、单克隆抗体大量制备体外培养法可获10μg/ml抗体体内诱生法可获5～20mg/ml抗体用BALB/c小鼠。降植烷接种杂交瘤细胞取腹水离心上清。抗体制药医学知识专家讲座第24页

六、单克隆抗体纯化依单抗IgG类和亚类不一样，选各种不一样纯化方法。体内诱生法单克隆抗体纯化方法：1离心取上清，超滤，盐析。2分离⑴凝胶过滤用于IgGIgM单抗纯化。⑵阴离子交换层析IgG单抗纯化。⑶亲和层析IgG单抗纯化。抗体制药医学知识专家讲座第25页第三节鼠源性单克隆抗体

改造

杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性单抗进行基因加工和改造。目标：降低免疫源性；降低相对分子量。人-鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体。抗体制药医学知识专家讲座第26页抗体制药医学知识专家讲座第27页Ig分子结构抗体制药医学知识专家讲座第28页Ig分子基因结构抗体制药医学知识专家讲座第29页一、人鼠嵌合抗体

抗原抗体结合功效—抗体可变区（V）同种性免疫源性—抗体稳定区（C）在基因水平上将鼠源单抗H和L链可变区基因分离出来，分别与人IgH和L链稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表示完整人-鼠嵌合抗体。抗体制药医学知识专家讲座第30页二、改形抗体（CDR移植抗体）Ig分子中参加组成抗原结合部位区域是H和L链V区中互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。用鼠源单抗CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人Ig分子含有鼠源单抗抗原结合特异性。可消除免疫源性。抗体制药医学知识专家讲座第31页抗体制药医学知识专家讲座第32页三、小分子抗体

基因工程小分子抗体仅表示鼠源单抗V区片段，相对分子量为原抗体1/80～1/3。即保留CDR区，而Ig分子中C区不表示。小分子抗体类型有：①Fab片段抗体②Fv抗体③单链抗体抗体制药医学知识专家讲座第33页④单域抗体⑤最小识别单位单链抗体优点：①可去除非特异性反应竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景愈加清楚性。②易渗透肿瘤组织中增加药品治疗浓度。③免疫源性小，可消除人抗鼠排异反应。抗体制药医学知识专家讲座第34页

单链抗体大多在大肠杆菌中表示，有三种形式：①直接在细胞质中表示；②与其它菌体融合表示融合蛋白；③分泌表示含有功效单链抗体。抗体制药医学知识专家讲座第35页四、双功效抗体双功效抗体就是双特征抗体。它是一个非天然性抗体。其结合抗原两个臂含有不一样特异