造血干细胞捐献者的基因分型

造血干细胞捐献者的基因分型第一页，共三十页，2022年，8月28日主要工作流程一、各“工作站”将审核、遴选合格的造血干细胞捐献者血样（贴有骨髓条码），以及捐献者样本清单（捐献者姓名及骨髓编号），一并送达我研究所免疫遗传实验室；二、免疫遗传实验室对捐献者血样进行HLA-A、B和DRB1基因定型，对送检血样的HLA基因定型结果负责；

三、出具“捐献者HLA基因分型检测结果”报告。第二页，共三十页，2022年，8月28日主要内容

（1）捐献者HLA基因定型血样的运输（2）HLA相关基本概念（3）HLA分型（定型）技术

HLA血清学分型技术

HLA基因分型技术第三页，共三十页，2022年，8月28日捐献者HLA基因定型血样的运输注意事项：1、因“登记表”中填写的内容审核不合格血样、以及经HBV等化验检查健康不合格的血样，予以剔除；2、检查血样管有无破管；3、路途远、条件许可，可放置适量干冰；4、由专人运送，防震、防颠覆；5、合格的HLA基因定型血样与捐献者样本清单一并送往组织配型实验室。第四页，共三十页，2022年，8月28日人类白细胞抗原(HumanLeucocyteAntigen,HLA)1958年，Dausset采用白细胞凝集实验，检测出第一个人类白细胞抗原Mac（A2）。为高度复杂的遗传多态性系统，每个人的HLA千差万别，即人体生物学的“身份证”，不同的民族、同一民族不同的地域，HLA基因及单倍型分布有其特点，HLA为人类主要组织相容性系统（MHC），与移植排斥反应密切相关，又称移植抗原。是机体“识别自身”、“排除异已”的主要遗传标记，参与免疫应答反应。HLA基因家族位于人类第6号染色体短臂，全长3.6Mb，HLA基因家族是迄今为止最复杂、多态性最丰富、免疫功能相关基因最集中、与疾病关联最密切的一个区域。第五页，共三十页，2022年，8月28日HLA抗原的分类HLA-I类：由一条具有多态性的α多肽链和一条没有多态性的2微球蛋白通过非共价键组成异二聚体。经典HLA-I类抗原：包括HLA-A、B、C位点抗原，分布于几乎所有有核细胞表面上。如T淋巴细胞、B淋巴细胞等，血小板上吸附HLA-A、B抗原。非经典HLA-I类抗原：包括HLA-E、G、F位点抗原，抗原在特定时间选择性分布。HLA-II类：由34KD的链和29KD的β链以非共价键连接而成，包括HLA-DR、DP、DQ抗原；仅分布于B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞等少数细胞表面。HLA-Ⅲ类：主要包括补体分子C2、C4及Bf等。第六页，共三十页，2022年，8月28日HLA抗原结构第七页，共三十页，2022年，8月28日HLA的免疫原性及骨髓库建库工作中

常规检测的HLA位点HLA是一个高度复杂的遗传多态性系统，如：

经典HLA-I类抗原：HLA-A、B、C位点抗原；非经典HLA-I类抗原：HLA-E、G、F位点抗原

HLA-II类：HLA-DR、DP、DQ位点抗原HLA的免疫原性，主要以HLA-A、B和DRB1的免疫原性较强，因此，骨髓库建库工作中，通常仅对HLA-A、B和DRB1位点进行定型。无关供者骨髓移植中，NMDP、JMDP有研究资料表明，供/受者对HLA-CW基因的匹配程度，与GVHD、移植成活率相关。第八页，共三十页，2022年，8月28日HLA基因定位于人类第6号染色体短臂（6p21.31），全长3.6Mb，占人类基因组碱基数的0.1%。HLA-I类基因：有10个遗传座位，靠近染色体顶端，HLA-A、B、C、E、G、F为表达基因，H、J、K、L为假基因，无基因产物。

HLA-Ⅱ类基因：靠近染色体着丝粒端，主要包括HLA-DR、DP、DQ基因座。第九页，共三十页，2022年，8月28日HLA基因结构体细胞为二倍体，同源染色体之间相互配对，每一HLA位点有2个等位基因，一个来自于母亲，另一个来自于父亲。检测HLA-A、B和DRB1三个位点，有6个等位基因，即6个HLA分型数据。第十页，共三十页，2022年，8月28日检出的HLA抗原及等位基因2003年世界卫生组织（WHO）HLA因子命名委员会命名的HLA等位基因：

HLA座位等位基因特异性

HLA-A25024HLA-B49049HLA-Cw11913HLA-DRB131517HLA-DPB1996HLA-DQB1537HLA系统等位基因丰富，每个人的等位基因型千差万别，可以说在随机人群中，难以有完全相同的。第十一页，共三十页，2022年，8月28日HLA的命名1、血清学命名：遗传位点后用数字表示，如A1、A2、A3、B5等。

以大写字母A、B、C…表示HLA的遗传座位；HLA特异性以数字表示；除HLA-A、B位点抗原的特异性的命名数字不重复外，其它位点抗原连续独立命名；C位点抗原以Cw为字首命名，以和补体系统区别。2、HLA等位基因命名原则：位点后加“*”，再加数字表示。如DRB4*0103102N

第1、2位数表示HLA抗原的特异性，第3、4位数表示等位基因（亚型），结尾加N表示无效等位基因或不表达基因。

HLA等位基因所对应的血清学特异性，可查阅过WHO公布的HLA字典。

HLA低分辨水平基因定型：确定HLA基因前2位数。HLA高分辨水平基因定型：确定HLA基因第4位以后的数字。第十二页，共三十页，2022年，8月28日HLA的生物学功能HLA参与免疫应答反应，与抗原肽结合形成HLA-抗原肽复合物，抗原提呈细胞将此复合物交由T淋巴细胞处理，T细胞上的T细胞受体（TCR）能够对抗原提呈细胞上的HLA-抗原肽复合物产生双识别，从而介导免疫反应。第十三页，共三十页，2022年，8月28日T细胞受体对HLA-抗原肽复合物的

双识别作用第十四页，共三十页，2022年，8月28日人类白细胞抗原（HLA）的应用HLA分型在骨髓和器官移植组织型法医学亲子鉴定和个体识别人类种群学安全输血疾病相关联的研究等领域（如HLA-B27）第十五页，共三十页，2022年，8月28日HLA分型技术1、传统的血清学和细胞学分型方法

因需要有活性的细胞、定型血清或分型细胞来源困难、分型准确性较差等原因，已逐步被淘汰。

2、PCR为基础的HLA基因分型技术分型所需要的血样量少，不需要有活性的细胞，实验重复性好、结果的准确性高，易于质控和准标化。HLA基因分型技术取代了血清学方法。当前的“中国造血干细胞捐献者资料库”的建库技术，不同于以往的“中华骨髓库”。前者采用基因定型技术检测HLA-A、B、DRB1基因，后者采用血清学方法检测HLA-A、B抗原。第十六页，共三十页，2022年，8月28日“中国造血干细胞捐献者资料库”对捐献者血样HLA基因分型技术的要求对HLA-A、B和DRB1进行基因分型，分辨率达低分辨水平。结果既报告每一样本的基因型，同时报告对应的特异性。通过各省级组织配型实验室室内质控，以及国家“HLA质控实验室”组织的室间质控对HLA基因分型的准确性进行质量监控。第十七页，共三十页，2022年，8月28日HLA基因分型技术PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）PCR-SSO流式磁珠分析HLA测序分型（SBT）PCR-序列特异性寡核苷酸探针（PCR-SSOP）基因芯片技术参比链介导的构象分析(RSCA)HLA单倍体基因测序第十八页，共三十页，2022年，8月28日HLA基因分型的步骤

1、DNA提取

2、PCR扩增

3、PCR扩增产物的检测

4、结果分析（判别受检者HLA基因型）

5、HLA基因定型报告

第十九页，共三十页，2022年，8月28日

PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型技术

基本原理：

使用序列特异性引物（SSP）特异性扩增HLA等位基因，电泳分离PCR扩增产物，根据是否存在PCR产物以及片段大小，确定相应基因。主要步骤：

1、DNA提取

2、PCR扩增

3、琼脂糖凝胶电泳检测

4、结果分析第二十页，共三十页，2022年，8月28日PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型技术第二十一页，共三十页，2022年，8月28日PCR-序列特异性引物

（PCR-SSP）分型技术特点：简便、快速、直观等，特别适合于尸肾移植的组织配型；所需设备简单，易于开展；为常规采用的经典HLA基因分型技术。应用：适合于经典HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子的基因分型分辨率：低分辩、高分辩基因分型水平。第二十二页，共三十页，2022年，8月28日PCR-SSO流式磁珠分析技术

基本原理：以反向核酸杂交为基础，杂交产物采用流式磁珠仪进行自动检测，为高通量HLA基因定型技术。第二十三页，共三十页，2022年，8月28日PCR-SSO流式磁珠分析技术的特点（一）实验原理、引物设计、扩增产物的检测等，与SSP分型技术不同。PCR扩增反应结束后，将标记探针的磁珠直接加入PCR产物中，微量离心管（反应板）置于PCR扩增仪上进行分子杂交；杂交产物用流式磁珠仪进行自动进样检测，用HLA分析软件确定HLA基因型。

第二十四页，共三十页，2022年，8月28日流式磁珠分析技术的特点（二）配合DNA全自动DNA提取仪及多个PCR基因扩增仪，具有高通量、操作简便、快速特点。适合骨髓库、脐血库大批量样本的HLA基因分型工作。基于流式磁珠分析技术，已有多家商品化、低分辩水平的HLA基因分型试剂盒。可用于HLA-A、B、C、DRB1和DQB1座位的基因分型。第二十五页，共三十页，2022年，8月28日HLA测序分型（SBT）技术HLA-座位

检测对象HLA-A第2，3，4外显子的正、反向序列HLA-B第2，3，4外显子的正、反向序列HLA-Cw第2，3外显子正、反向序列HLA-DRB1第2外显子正、反向序列，Condon86反向序列。HLA-DQB1第2外显子正、反向序列，第3外显子的反向测序。若存在DQB1*0201/0202或0301/0309，分析第3外显子的测序结果。第二十六页，共三十页，2022年