农业大学病毒学实验技术之病毒纯化

第六章病毒纯化利用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩病毒样品。病毒微细结构研究病毒抗原蛋白分离纯化病毒化学成份及其遗传物质研究病毒感染分子细节研究农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第1页一、病毒纯化标准保持感染性含有均一性：结晶形成检测病毒制备物均一性方法：电镜观察：大小、形态均一超速离心：沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带电泳：颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带免疫学方法：只与特异性抗体发生反应大小、形态、密度、化学组成、分子量、抗原性农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第2页二、病毒纯化理论依据病毒体外表面主要化学组成是蛋白质，可利用蛋白质提纯方法纯化病毒病毒体含有一定大小、形状和密度，可利用超速离心技术提纯病毒农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第3页三、病毒纯化前预处理1、病毒感染组织、脏器或细胞研磨匀浆超声波处理重复冻融低速离心去掉细胞碎片2、细胞培养液、鸡胚尿囊液低速离心去掉可能含有杂质或直接用于病毒分离纯化农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第4页沉淀法超速离心法超滤法层析法两相溶剂间分配系数法吸附法电泳法四、病毒纯化方法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第5页（一）沉淀法主要从稀病毒悬浮液中浓缩病毒。中性盐沉淀法（盐析）聚乙二醇沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法皂土法鱼精蛋白沉淀法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第6页1、中性盐沉淀法（盐析）先用其它方法去除材料中大量杂质，再以高浓度中性盐溶液盐析，析出沉淀用缓冲液悬浮后再进行盐析，重复几次后，悬浮沉淀，用透析法或其它方法脱盐。病毒普通在45%以上饱和度硫酸铵溶液中沉淀，且保持感染性。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第7页2、聚乙二醇（PEG）沉淀法用于病毒沉淀分子量：-6000将PEG配成50%左右溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其到达所需浓度，在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第8页3、有机溶剂沉淀法乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物原理：A、降低溶液介电常数，从而增加病毒颗粒表面不一样电荷之间引力，造成其溶解度降低。B、与水作用，破坏蛋白质分子水化膜。优点：分辨力高，易除去缺点：易使表面蛋白质变性，溶解脂质农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第9页4、等电点沉淀法（分辨力不高）原理：病毒粒子在等电点时，所携带正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥作用而发生沉淀（分辨力不高）。多数病毒等电点在pH4.０~5.5之间。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第10页5、皂土法轮状病毒皂土在酸性条件下（pH4~4.5)可吸附轮状病毒，在碱性条件下(pH8.5)，又使其洗脱下来。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第11页6、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于50nm病毒）鱼精蛋白为碱性蛋白，含有携带其它蛋白质（直径大于50nm）共沉淀作用，当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白依然沉淀。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第12页（二）层析法葡聚糖柱层析法凝胶层析法离子交换柱层析法亲和层析法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第13页（三）两相溶剂间分配系数法原理：溶质在两个互不相溶溶剂中分配系数不一样而选择性地分配于其中一方。惯用溶剂：葡聚糖硫酸盐（dextransulphate,Ds)聚乙二醇（PEG）甲基纤维素（MC）聚乙烯醇（PVA）分配体系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第14页（四）吸附法原理：利用对病毒或对杂质有选择吸附能力固体吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定盐溶液把它们洗脱下来。

作为吸附剂必须具备特点：有较大表面积和吸附能力较高吸附选择性便于洗脱性质稳定农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第15页惯用吸附剂：白土磷酸钙硅藻土红细胞离子交换树脂羧甲基纤维素农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第16页（六）超滤法利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。优点：可用于大容量样品浓缩能够在室温或低温下操作对被浓缩产物损害小浓缩同时可到达部分纯化回收率高可预防外来污染（五）电泳法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第17页（七）离心法差速离心速度区带离心法密度梯度离心农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第18页1.差速离心法原理：不一样大小和比重粒子沉降速度不一样。用途：从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附释放病毒悬液中提纯病毒。优点：可快速处理大量样品步骤：低速（-3000r/min,20-30min)、中速（10000min,20-30min)去除较大宿主细胞碎片、污染细菌及其它较大杂质。再选择较高速度离心1-2h使病毒沉淀。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第19页速度梯度离心法密度梯度离心法原理沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度不一样进行分离沉降与颗粒密度成正比，以物质浮密度不一样进行分离介质密度小，1-1.3286，预制梯度，不连续密度大，1-1.9025，连续梯度离心力场强，离心速度高，使被分离物质易沉降稍强，速度相对低，使CsCl形成梯度，建立沉降扩散平衡离心过程样品向离心管底沉降样品停留于介质等密度部位离心时间较短，几小时到几十小时较长，十几小时到数天2.速度梯度离心法与密度梯度离心法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第20页速度梯度离心密度梯度离心…………AB农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第21页五、病毒纯化应注意问题1、保持病毒感染性严格控制温度、pH及试剂选择。2、选取适宜纯化试验起始材料无其它病毒或毒株污染病毒体含量高杂质含量少并易于处理农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第22页3、依据详细情况选择提纯方法依据需要纯化病毒性质、起始材料特点、研究目标以及试验室条件等，选择适宜纯化方法。4、建立灵敏病毒判定和测定方法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第23页六、伪狂犬病毒浓缩提纯1、病毒材料将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞，病变后搜集细胞培养物，重复冻融3次，即为样品材料。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第24页2．病毒提纯浓缩去细胞碎片及杂质：将细胞培养物4℃3000r/min离心30min，搜集上清液。硫酸铵沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸铵量加入硫酸铵，搅匀后置4℃冰箱搅拌沉淀过夜，4℃5000r/min离心40min，去上清，沉淀用适量灭菌ddH2O悬浮。透析：将悬浮病毒液装于透析袋中，于ddH2O或PBS中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次，第5次透析过夜。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第25页浓缩：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病毒浓缩至适当体积。超离纯化：在离心管中加入不一样浓度甘油垫层，即先加入45%甘油，再加入5%甘油。加入病毒悬液（应不超出离心管总容积10%）。0-25000r/min离心2h。弃上层液体，沉淀用适量TEN重悬（涡旋或超声波处理，使沉淀分散）。速度区带离心农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第26页密度梯度离心在离心管中加入不一样浓度CsCl或蔗糖垫层，再加入病毒悬液，超高速离心。蔗糖密度梯度离心：在离心管中加入20%～60%不连续蔗糖密度梯度,0-25000r/min离心2h～3h，搜集蔗糖浓度为35%处病毒带，加入适量缓冲液稀释后，再次0-25000r/min离心2h，沉淀用适量TEN重悬。

PrV鄂A株电镜观察左图：上带中PrV粒子右图：下带中PrV粒子农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第27页浓缩（方法二）将经低速离心去掉细胞碎片及杂质病毒悬液直接0-25000r/min离心2h。弃上层液体，沉淀用适量TEN重悬。将重悬病毒液再经梯度离心纯化。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第28页怎样利用纯化病毒进行下一步研究研究病毒结构研究病毒感染分子细节病毒粒子标识研究与受体结合研究病毒侵入研究病毒在体内移行农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第29页病毒纯化质谱分析靶蛋白验证纯化病毒是不是只含有病毒蛋白？农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第30页