质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座

质粒提取和限制性内切酶消化质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座第1页目巩固质粒概念，经过原理部分学习加深对质粒DNA与染色体DNA理化性质差异认识学习碱裂解法提取质粒DNA方法掌握酶切反应操作质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座第2页质粒提取质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座第3页质粒是染色体外小型（1-200kb）共价、闭合、环状双链DNA分子，能自主复制并能稳定遗传遗传因子。是进行DNA重组惯用载体。经常编码一些对宿主有利酶基因，这些基因表型主要为抗生素抗性。质粒

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Ampr抗性基因Ampr抗性基因编码一个周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Ampβ-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座第5页常用质粒提取方法煮沸法对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。提取质粒DNA中会含有RNA。碱裂解法质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座第6页碱裂解法提取原理

宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA结构状态差异

加入碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕自然状态而不能彼此分开当条件恢复时（酸中和），质粒DNA快速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子。因为操作原因，提取质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座第7页①收菌②重悬③裂解④中和⑤过柱⑥洗涤⑦洗脱质粒提取试剂盒操作步骤

P1:50

mM葡萄糖

，25

mM

Tris-HCl,10

mMEDTApH

8.0

P2:0.2

M

NaOH,1%

SDSP3:3

M

醋酸钾,2

M

醋酸

硅基质膜在高盐低pH值（pH≤7.5）时可结合DNA，在低盐及高pH值（pH≥8）条件下洗脱。75%乙醇对数生长后期质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座第8页取菌液12,000rpm离心2min

弃上清（尽可能吸尽上清）用250uLPI重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮加入250uLP2，温和地上下颠倒6-10次(溶液粘稠清亮)加入350uLN3,马上温和上下翻转6-10次（白色絮状沉淀）12,000rpm离心10min小心吸收上清，加入吸附柱12,000rpm离心1min弃滤液加入700uLbufferPW12,000rpm离心1min，弃滤液空柱12,000rpm离心2min，室温开盖放置3–5min加入500uLbufferPW12,000rpm离心1min，弃滤液吸附柱置于新离心管中，加入50-100uLbufferEB,室温放置2min，12,000rpm离心1min，搜集质粒溶液到离心管，-20℃保留。CWBIO质粒提取和限制性内切酶消化专家讲座第9页取菌液12,000rpm离心2min

弃上清（尽可能吸尽上清）用250uLPI重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮加入250uLP2，温和地上下颠倒6-10次(溶液粘稠清亮)加入350uLP3,马上温和上下翻转6-10次（白色絮状沉淀）12,000rpm离心10min小心吸收裂解上清，加入吸附柱12,000rpm离心1min弃滤液加入500uLbufferPD12,000rpm离心1min，弃滤液空柱12,000rpm离心2min，室温开盖放置3–5min加入600uLbufferPW12,000rpm离心1min，弃滤液（重复一次）吸附柱置于新离心管中，加入50-100uL洗脱液EB,室温放置2min，12,000rpm离心1min，搜集质粒溶液到离心管，-20℃保留。T&G（500uL平衡液BL，加入吸附柱12,000r