第六章基因操作中大分子的分离和分析

第一节DNA的分离、检测和纯化分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）②排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染。③无其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应去除RNA分子）。当前1页，总共151页。分离核酸应注意以下几点：①减少化学因素对核酸的降解：酸、碱②减少物理因素对核酸的降解：机械力③防止核酸的生物降解：进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。当前2页，总共151页。1.1DNA提取的步骤一、细胞破碎二、除去与核酸结合的蛋白质等杂质三、除去其他杂质核酸四、获得DNA样品当前3页，总共151页。一、细胞破碎目前细胞破碎主要有物理破碎（主要是机械破碎）和非物理破碎（主要化学破碎和生物酶解）

当前4页，总共151页。（一）、物理破碎

目前常用物理破碎的方法主要有：均质珠子研磨振荡、液氮研磨、乳钵研磨、冻融、煮沸、超声波(ultrasonication)和微波加热(microwaveheating)等。1、微波加热对于革兰氏阳性细菌非常有效，但是加热必须适中，否则DNA可能被破坏。

当前5页，总共151页。2、热激处理包含冷冻和融解两步，冷冻主要是用液氮、冰箱(−70℃、－20℃)或冰，而融解主要是37℃、50℃、65℃或100℃水浴，其中冻融循环次数和孵育时间可以根据不同要求变化。如，Lee(1996)等通过用吖啶橙染色直接统计经三次热激(−70℃/65℃)联合溶菌酶和SDS处理后的细胞裂解率为90%。

热激处理比其他物理处理的剪切力要小很多，而且提取效率、得到片段完整性较好。当前6页，总共151页。3、珠子打击法(beadbeating)加入不同直径的玻璃珠，有利于不同细胞DNA的提取：①直径为710～1180μm玻璃珠可打碎土壤块和植物细胞；②425～600μm玻璃珠可打碎真菌、植物和其他真核细胞；③106μm玻璃珠可打碎细菌细胞。在使用玻璃珠研磨法时，应在珠子大小和数量上具有合适的配比，这样才能有效地破碎和抽提微生物的营养细胞、内生孢子或分生孢子的DNA。当前7页，总共151页。珠子打击法优点：有更好的裂解效率和产量，而且其DNA产量随着打击时间和打击速度的增加而增加，因此，可以用较小的抽提缓冲液体积处理较小的样品得到满意的获得率。珠子打击法缺点：随着打击处理而增加产量的同时，剪切力增大并导致小片段增加，从而影响PCR的敏感性，甚至可能增加嵌合体形成率而影响随后的分子生物学处理及结果，特别是引起多样性分析的偏差。当前8页，总共151页。（二）非物理破碎法非物理破碎法相对比较温和，利于保持DNA的完整性。其主要是包括化学破碎和生物酶解。当前9页，总共151页。1、化学破碎目前化学破碎法常用的化学试剂主要是阴离子型去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）、Sarkosyl（N-十二烷基肌氨酸钠）和阳离子型去污剂CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）等。

当前10页，总共151页。2、生物酶解在生物酶解中最普遍使用的是溶菌酶，其主要是通过水解细胞壁而达到裂解细胞的目的，特别是对革兰氏阳性菌的破碎，同时溶菌酶还可以水解糖苷键和腐殖酸的化合键从而改善DNA纯度。由于生物酶解比较温和，故其常常还需要跟化学、物理等裂解方法联合使用。目前除了使用溶菌酶外，也有添加旨在提高革兰氏阳性菌裂解的消色肽酶(achromopeptidase)、消化蛋白的蛋白酶K(proteinaseK)(主要通过酶解膜蛋白来提高裂解细胞以及消化蛋白而有利于随后的核酸分离纯化)以及在富含有机酸的样品中有利于核酸释放的链霉蛋白酶(pronase)等。当前11页，总共151页。一般来说，单独使用一种处理方法效果都不会很好，而适当的组合可产生很好的效果。当前12页，总共151页。二、除去与核酸结合的蛋白质等杂质苯酚对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响；氯仿也可使蛋白质变性，对DNA无影响；蛋白酶可降解蛋白质，故在实验中也常使用。注：苯酚的残留会严重干扰后续的分子操作，故用苯酚去除蛋白质后还需用氯仿/异戊醇（24:1）抽提两次，以去除残留的蛋白质和苯酚。当前13页，总共151页。三、除去其他杂质核酸在DNA提取中会有少量的RNA杂质残留，但RNA极易降解，一般情况下对后续的DNA操作无大影响。如要求DNA纯度较高时可加入RNA酶（RNase）以降解RNA。当前14页，总共151页。四、获得DNA样品含DNA的水相可用以下几种沉淀剂沉淀：a.无水乙醇（最常用）：易于从DNA沉淀中除去。但所需的体积大（2倍），由于使用的管多为一次性，比较浪费。b.异丙醇：能与自由水紧密结合。结合了溶解DNA的水分子，使DNA沉淀。可常温沉淀，离心，加入体积为0.6—1倍体积，但不易除去，需用70%酒精洗涤几次，否则对后续分子操作有影响。异戊醇：几乎不能与自由水结合，但可分离有机醇与溶液层，还可去气泡，也可做去蛋白的辅助剂。c.PEG（聚乙二醇，分子量6000—8000）选择性沉淀：低浓度PEG（如1%）选择沉淀大分子DNA，在构建基因组文库则用低浓度PEG沉淀几十kb；高浓度PEG（20%），选择沉淀小分子，几百bp。如：PBR3224.3kb用PEG12%沉淀。PEG选择沉淀的分辨率达100bp。当前15页，总共151页。沉淀时的注意事项：（1）当DNA分子量<1kb或浓度较低,<1μg/ml，加入沉淀剂后应在-70℃下几小时或过夜，否则回收不彻底。此外，应16000rpm离心；（2）DNA>1kb，加入沉淀剂后再加入糖原，几分钟可↓完全；（3）DNA<200bp，回收时，先加MgCl2至终浓度达10mmol/L，再用乙醇沉淀；（4）溶液中磷酸盐>1mmol/LorEDTA>10mmol/L，则用乙醇沉淀得不到DNA，应选其它方法沉淀DNA。当前16页，总共151页。DNA样品的贮存：4℃短期贮存;-20℃长期贮存，冰上缓解冻（取时）；也可将DNA样品以乙醇沉淀的形式保存在-20℃。当前17页，总共151页。Figure3.4

Preparationofacellextract.Preparationofacellextract当前18页，总共151页。Figure3.5

Removalofproteincontaminantsbyphenolextraction.◆

PurificationofDNAfromacellextract当前19页，总共151页。Figure3.6CollectingDNAbyethanolprecipitation.◆ConcentrationofDNAsamples当前20页，总共151页。两种经典的化学试剂提取法：

1、CTAB法

2、SDS法当前21页，总共151页。❶CTAB法（1）原理：CTAB,十六烷基三甲基溴化铵是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。当前22页，总共151页。（2）具体操作：在所需量的CTAB抽提液中加入β－巯基乙醇，使终浓度达2％（v/v）。将此溶液预热至65℃。对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的β－ME/CTAB抽提液。用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷却粉碎器/匀浆器，将0.5g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0ml离心管。加入800µl预热的β－Me/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育20min，不时颠倒混匀。待冷至室温后，加入800µl氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀至溶液呈乳浊状（但不要振荡）。25℃，10000rpm离心10min。当前23页，总共151页。⑤上清（约700µl）转移至另一干净的离心管中，加入5µlRNaseA贮液，37℃温育30min。⑥加入700µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，25℃，10000rpm离心10min。⑦上清（约600µl）转移至另一干净的1.5ml离心管中，加入600µl异丙醇，颠倒混匀，室温或-20℃放置20min。⑧25℃，12000rpm，离心10min，收集沉淀。⑨去上清，加1ml70%乙醇洗涤沉淀两次（25℃，12000rpm，离心10min）⑩晾干DNA，溶于50µlddH2O，4℃保存备用。当前24页，总共151页。（3）优缺点：①能很好地去除糖类物质；②在提取的前期能同时得到高含量的DNA及RNA；③步骤多，复杂，提取的DNA分子量比SDS法小。当前25页，总共151页。（4）说明：β—巯基乙醇的作用：a.是一种蛋白质的辅助变性剂；b.主要作还原剂，加入溶液中可防止整个溶液的氧化，大大提高DNA得率。由于气体（多酚类物质）刺鼻，通风柜操作。当前26页，总共151页。❷SDS法（1）原理:利用高浓度的SDS，在较高温度（55—65℃）条件下裂解细胞，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

当前27页，总共151页。（2）过程：将0.3g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2ml离心管中。加入1.2ml预热至65℃的提取缓冲液（其中加入3μlβ—巯基乙醇，增加DNA的稳定性），置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。加入0.45ml5M的醋酸钾，混匀，冰浴20分钟，在10000rpm离心20min。需要的话，用纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000rpm离心15min。当前28页，总共151页。⑥转移上清液到另一新离心管中，加5μlRNaseA贮液，37℃温育30min。⑦加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000rpm离心15min。⑧转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟沉淀核酸。⑨25℃，12000rpm，离心10min，收集沉淀。⑩弃上清，70％乙醇洗两次。凉干DNA，溶于50µlddH2O，4℃保存备用。当前29页，总共151页。（3）与CTAB法比较：SDS法较温和，对DNA的切割不大，可获得大分子量的DNA。故该法可建立基因组文库，多酚类物质的材料适用。该法极易造成SDS-DNA共沉淀。对SDS质量要求较高。称取SDS时，动作要缓慢，因SDS易于形成微颗粒。溶解时，水应沿壁使水轻缓流下，56℃助溶。

当前30页，总共151页。例1：水稻基因组DNA提取取3-5g新鲜水稻叶片，用液氮速冻，在研钵中快速研成粉末状，转入50ml离心管中；立即加入20ml预热至65℃的提取缓冲液，65℃水浴30min；加入7.5ml5M醋酸钾，轻轻混匀，冰上放置20min，4000rpm离心20min。将上清转入另一干净的50ml离心管中；加入15ml氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，4000rpm离心20min。将上清转入另一个干净的50ml离心管中；加入15ml冰预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min；4000rpm离心20min，弃上清，用20ml70%的乙醇洗一遍，倒置离心管于干净的滤纸，室温晾干沉淀；将沉淀重悬于0.6mlTE缓冲液，加10µl10mg/mlRNA酶，37℃保温10min；转入干净的2ml离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），12000rpm离心10min；将上清转入一干净的2ml离心管中，加入1/10体积冰预冷的3M醋酸钠（pH5.2），2倍体积冰预冷的无水乙醇，12000rpm离心30min。弃上清，用70%的乙醇洗一遍，晾干后，容于500µlTE，保存于-20℃备用。当前31页，总共151页。例2：细菌DNA大量提取吸取1ml过夜培养的细菌于50ml不加抗生素的PSA中，28℃，200rpm过夜培养；6000rpm离心5分钟，收集菌体；用50ml冰冷的1×TE冲洗菌体两次；将菌体重新打散，悬于20ml1×TE中；加入（37℃预消化1小时）的蛋白酶、SDS使其终浓度分别为625g/ml(w/v)及1.25％（w/v）,冰浴45分钟至有白色SDS析出；室温放置30分钟，不时轻轻摇动；3%NaCl饱和的苯酚、苯酚/氯仿（1:1,v/v）及氯仿各抽提一次，收集上清于新的离心管；加入1/10体积的3MNaAc(pH4.8),再加等体积冰冷的异丙醇，混匀后置室温30min，待出现无色透明的白色絮状DNA，用Tip头吸出，室温干燥后溶于1xTE中；DNA保存于-20oC，可长期保存。

当前32页，总共151页。例4：人类DNA提取親手提取自己的DNA

作為“紀念DNA雙螺旋結構發現五十周年系列展覽”的一部分，現場萃取DNA制成挂件模型實驗，昨天在北京王府井新東安廣場舉行。十幾名學生在英國老師斯蒂娜的指導下親手萃取了自己的絮狀DNA，並制作成可愛的挂件，挂在脖子上。據悉，這次開放式實驗活動將持續到3日。

圖為北京外國語大學學生小周看見自己的DNA奇跡般地出現在試液中，驚奇不已。

本報記者吳平

張紅晉攝影報道

《京華時報》(2003年10月2日第2版)

当前33页，总共151页。1.2质粒DNA的提取1、碱裂解法◆碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。◆在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。◆当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。◆通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。基本原理：当前34页，总共151页。Figure3.11

Plasmidpurificationbythealkalinedenaturationmethod.当前35页，总共151页。三种溶液：溶液I：50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA：pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；

溶液III：3M醋酸钾/2M醋酸

提取步骤：当前36页，总共151页。pET28c(+)电泳结果

当前37页，总共151页。碱抽提法所用试剂的生化作用

提取过程中所用的材料有：LB培养基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris•HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、TE缓冲液、3mol/L乙酸钾溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、异丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。

当前38页，总共151页。①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,同时有利于溶菌酶的作用。

当前39页，总共151页。②NaOH-SDS液:NaOH浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为R-O-S03-…R+一蛋白质的复合物,使蛋白质变性沉淀下来。当前40页，总共151页。③KAc:

pH4.8的KAc溶液是为了把pHl2.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。高盐：3mol/LKAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体DNA因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。

当前41页，总共151页。④无水乙醇:沉淀DNA，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

⑤酚-氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。⑥异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。当前42页，总共151页。2、通过试剂盒分离纯化质粒DNA

分离纯化过程是通过一个简单的结合—洗涤—洗脱程序来完成的。

优点：该方法操作简单，回收效率高，洗脱出来后的DNA可立即使用，无需浓缩、沉淀或脱盐。

当前43页，总共151页。当前44页，总共151页。1.3琼脂糖凝胶电泳分离纯化的DNA是否真的存在、是否有降解现象，以及DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小如何等都是在基因操作中时刻面对的问题。目前最成熟的检测DNA的技术就是琼脂糖凝胶电泳。当前45页，总共151页。一、琼脂糖的特点及凝胶电泳的原理

琼脂糖是从海藻中提取出的一种线性多糖聚合物。在高温水溶液中会溶解，在常温下凝固并形成一定大小孔径的惰性介质。在电场的作用下，DNA可在孔洞中迁移。当前46页，总共151页。琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持物，在适当条件下对带电生物大分子进行电泳的技术。主要用于DNA分子的分离、纯化和鉴定。琼脂糖凝胶电泳的原理：DNA分子在溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，由于DNA分子的分子质量差别，电泳后不同大小的DNA分子呈现迁移位置的差异，把已知分子质量的标准DNA与待测DNA同时电泳，比较两者在凝胶板上所呈现的区带，就可以鉴定出待测DNA的大小。当前47页，总共151页。当前48页，总共151页。二、琼脂糖凝胶电泳基本操作步骤

在琼脂糖中加入电泳缓冲液→微波加热溶解→温度降至60℃左右时，加入电泳染料→混匀后倒入凝胶槽→待凝胶完全凝结后，小心拔去梳子→放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液，缓冲液高过凝胶面0.5cm→点样→根据需要设置电泳电压和时间，开始电泳→电泳结束后在凝胶成像仪上观察、照相→进一步分析。当前49页，总共151页。琼脂糖凝胶电泳的操作过程当前50页，总共151页。当前51页，总共151页。染色体DNA琼脂糖电泳图谱紫外线光源灵敏度:302nm>254nm>366nm当前52页，总共151页。当前53页，总共151页。电泳结果分析：0.8%的琼脂糖凝胶，应呈现一条清晰带。若呈长带状弥散荧光则表明DNA降解,原因可能有：①是否灭菌器皿及试剂；②材料收集是否立即冷冻，研磨（后）提取是否融化；③是否剧烈振动，吸管口过窄，产生气泡。反复吸打及冻融等问题。若在溴酚蓝处出现明亮的荧光，则有RNA，可用RNase消化。消化后用氯仿抽提，乙醇沉淀方法纯化。若在样品槽内有荧光出现，可能样品中DNA未完全溶解或浓度过高，或样品不纯，可能是大量带正电荷的杂质与DNA样品结合。当前54页，总共151页。

凝胶类型及浓度

分离DNA片段的大小范围（bp）

0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1三、琼脂糖凝胶电泳的影响因素1、凝胶浓度凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。具体的浓度及分离DNA片段的大小范围如下表。

当前55页，总共151页。2、DNA分子的大小和构象线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶上电泳距离与DNA的分子质量对数成反比。但当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子质量有关，还和它本身构象有关。有相同分子质量的线状DNA<开环状DNA<超螺旋DNA。当前56页，总共151页。3、电泳缓冲液目前常用的缓冲液有TAE（40mol/LTris-乙酸、1mmol/LEDTA）和TBE（90mmol/L硼酸、1mmol/LEDTA）。TAE缓冲液的缓冲能力较低，适用于低电压长时间电泳；TBE有较强的缓冲能力，是比较通用的缓冲液。当前57页，总共151页。4、指示剂

电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。目前常用的核酸电泳指示剂是溴酚蓝，呈蓝紫色。当前58页，总共151页。5、染色①溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）可很好地掺入到双链DNA中，在紫外光的激发下会呈现橙红色的荧光，便于鉴定，可用于对DNA进行染色和观察。②SYBRGreenI

:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较EB贵。

强烈诱变剂当前59页，总共151页。1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可很好的分辨100bp-1kb大小的核酸分子。对单链DNA来说，其分辨率可达1bp，这种分辨能力在DNA序列测定中发挥了重要作用。

特点：分辨率高；载样量大；回收DNA纯度高；适于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp当前60页，总共151页。当前61页，总共151页。当前62页，总共151页。1.5脉冲电场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PEGE）

1984年，D.C.Schwartz和C.R.Cantor发明。用来分离整条染色体这样的超大分子量DNA分子，如大肠杆菌染色体基因组DNA，>4000kb。DNA分子的迁移方向随所用电场方向的周期性变化而不断改变。可成功分离到分子量高达107bp的DNA大分子。

当前63页，总共151页。脉冲场凝胶电泳实际上是一种交替变化电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场方向，使DNA分子在微观上按“Z”字形向前泳动，从而到达分离大分子DNA的目的。与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1秒到5分钟左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。脉冲场凝胶电泳的工作方式：横向交变电泳（TAFE）、场翻转凝胶电泳（FIGE）、旋转凝胶电泳和箝位匀场电泳（CHEF）。其中使用最广泛的是CHEF。当前64页，总共151页。+++-----2当前65页，总共151页。当前66页，总共151页。当前67页，总共151页。当前68页，总共151页。脉冲电泳槽电泳仪冷凝器真空泵BIio-Rad公司CHEF-DR脉冲电泳仪当前69页，总共151页。影响脉冲场凝胶电泳的因素：脉冲时间、分子大小、电场强度、温度和电场间角度。若分子重新定向时间和脉冲时间的比值在0.1-1之间，对较长的DNA片段的分离具有最佳的分辨率。当前70页，总共151页。1.6DNA片段的纯化1、低熔点琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖总体上可分为两类：普通琼脂糖和低熔点（LMP

）琼脂糖。LMP琼脂糖的熔点为62-65℃，其一旦溶解，便可在37℃持续保持液体状态达数小时，而在25℃下也可持续保持液体状态约10min。当前71页，总共151页。纯化步骤：用LMP琼脂糖凝胶分离特定的DNA片段→切割带有目的DNA的琼脂糖凝胶块→加入适量缓冲液→加热到60℃使凝胶溶化，DNA进入水溶液中→通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀→获得纯化的DNA片段。（这是经典的DNA片段回收方法，现在一般比较少用。）其在回收大片段DNA时仍是一个比较好的办法，在回收大片段DNA时在加热融化后常用琼脂糖酶水解琼脂糖，从而减少残留的杂质，提高回收效率。当前72页，总共151页。2、透析袋电洗脱法

纯化步骤：将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来→放在透析袋中→置于电泳缓冲液中电泳→DNA分子在电场作用下从凝胶块中游离出来，贴在透析袋内壁上→取出凝胶块→更换新鲜缓冲液，反向电泳，使DNA游离于缓冲液中→取出含DNA的缓冲液→通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀→获得纯化的DNA分子。

透析袋电洗脱法现在多用来纯化相对分子量较大的DNA片段。

当前73页，总共151页。3、GlassMilk（bead）结合法该方法涉及两个关键技术：①琼脂糖凝胶在3倍体积的3mol/LNaI溶液作用下与55℃会溶化，从而使DNA释放到水溶液中；②在这样的高盐浓度下有一种硅粒（glassbead，硅的细微颗粒，其水溶液呈牛奶状，故也成为玻璃奶，glassmilk）可特异性吸附DNA。当硅粒吸附DNA后，通过离心的方法很容易对硅粒进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的DNA洗脱出来。该方法操作简便，回收效率高，易于推广。但回收的DNA片段一般不超过10kb，否则回收效率低。

当前74页，总共151页。4、纯化试剂盒纯化DNA

目前已有纯化各类DNA的商品试剂盒，大部分都是使用带硅胶膜的纯化柱吸附DNA，再经过洗涤、洗脱步骤得到纯化的DNA。该方法操作简便快速，且纯化效果好。但其只对小于10kb的DNA片段有好的纯化效果，且价格相对于其他方法较昂贵。（目前也有一些公司开发出可以纯化>20kbDNA的纯化试剂盒，有些还可纯化回收到50kb左右的DNA片段）当前75页，总共151页。1.7DNA或RNA的紫外分光光度法测定纯度

定量测定DNA或RNA时需要读取260nm和280nm两个波长下的读数。根据260nm处的读数可计算出样品中核酸的浓度，1个OD值相当于约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA和RNA及33μg/ml单链寡核苷酸。利用OD260和OD280的比值可计算出核酸的纯度，DNA的纯制品OD260：OD280为1.8，RNA的纯制品OD260：OD280为2.0.若低于这两个值说明核酸中含有酚或蛋白质等杂质。当前76页，总共151页。1.8DNA分离、纯化过程中常用到的有毒试剂1、SDS有毒，是一种刺激物，对眼睛会造成严重损伤，可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康。使用时需戴手套，称量时需戴口罩。2、β-巯基乙醇高浓度的β-巯基乙醇对黏膜、上呼吸道、皮肤和眼睛有严重的损失作用，使用时需要戴手套于通风橱操作。3、PEG可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。使用时需戴手套于通风橱操作。当前77页，总共151页。4、蛋白酶K是一种刺激物，使用时需戴手套。5、溴化乙锭（EB）是一种强诱变剂，使用时要避免吸入其粉末。在用含有EB的溶液工作时需戴合适的手套。6、苯酚具有很强的毒性和高度的腐蚀性，并能引起严重的灼伤，可因吸入、咽下或皮肤吸收而受到危害。使用时要戴手套，于通风橱操作。如皮肤接触到酚，需立即用大量的水冲洗接触酚的部位，并用肥皂和水洗。7、氯仿、异戊醇、异丙醇等溶剂都具有刺激性气味，可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康，使用时需戴手套于通风橱操作。当前78页，总共151页。第二节RNA的分离、检测和纯化

细胞内的RNA主要有：rRNA、tRNA、mRNA。对于基因操作来说，所需的RNA主要是mRNA，其在细胞中的含量最少，仅占总RNA的1%-5%。由于mRNA是单链的，容易受到核酸酶的攻击，导致在RNA操作过程中易降解。故RNA的提取要比DNA困难许多。实验成败关键：创造一个无RNase的环境去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙酯)抑制内源性RNase的活性RＮase阻抑蛋白（RＮasin，非竞争性抑制剂）氧铜核糖核苷复合物硅藻土当前79页，总共151页。2.1控制潜在RNA酶的活性

一、溶液和用具的去RNA酶处理RNA酶能耐高温，即使是高温湿热灭菌也不可能完全清除其活性。对于一些耐热的物品，如玻璃制品，可通过高温干热灭菌。（180℃烘箱中烘烤8h以上）对于一些塑料物品，如移液吸头和微量离心管，应用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水浸泡后再灭菌，或者购买无RNA酶污染的用具。当前80页，总共151页。对于电泳用具最好使用专用的，不要用于其他分析，并且在使用之前用洗涤剂洗刷干净，再用3%H2O2和0.1%DEPC处理的水浸泡，清洗干净。对于可能接触RNA的溶液，需要用DEPC处理的水配制。在提取过程中要戴口罩，尽量少讲话，始终戴一次性橡胶手套，并且经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶污染用具。（不要使用一次性塑料手套，因为塑料手套多出的部分常常在器具的RNA酶污染处和无RNA酶处传播RNA酶，扩大污染。）当前81页，总共151页。二、RNA酶抑制剂的使用目前应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘RNase抑制剂。除此外，还有氧铜核糖核苷复合物和硅藻土。当前82页，总共151页。2.2RNA的抽提和纯化RNA提取的一般步骤：①破碎细胞；②使核蛋白复合体充分变性，即使核蛋白迅速与核酸分离；③抑制内源RNase以及容器污染的外源RNase的活性；④将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开。当前83页，总共151页。1、酚—异硫氰酸胍抽提法(TRIZOL试剂)

TRIZOL试剂是使用最广泛的抽提总RNA的专用试剂，主要由苯酚和异硫氢酸胍组成。对任何生物材料的RNA提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂后，可保持RNA的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含RNA的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。

Trizol的主要成分是酚，主要作用是裂解细胞。酚不能完全抑制RNA酶活性。0.1%的8-羟基喹啉与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制；异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。

当前84页，总共151页。2、硅胶膜纯化法（纯化柱试剂盒）设计思路与DNA的分离纯化思路相似：含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，核酸吸附在硅胶膜上，从而与其它细胞成分分开，然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出来。

当前85页，总共151页。2.3mRNA的纯化

mRNA的纯化主要是针对于真核生物的，由于真核生物mRNA的3’端有一个poly（A）尾，可与oligo（dT）-纤维素吸附，从而可利用亲和层析的方法纯化。对于原核生物，其mRNA与其他的RNA没有明显的结构差异，难以从总RNA中纯化出来。当前86页，总共151页。当前87页，总共151页。2.4RNA的电泳检测

通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA分析与DNA分析的原理是类似的。不同的是，由于RNA呈单链状态，易形成链内二级结构。为保证电泳过程中RNA的迁移率与其相对分子质量呈线性关系，因此，RNA分析是在变性条件下进行的。常用的变性剂为甲醛，也可使用氢氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亚砜（DMSO）。当前88页，总共151页。当前89页，总共151页。第三节分子杂交分子杂交是在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及期相对分子质量的大小。生物化学中分子杂交是指DNA在变性后，在复性的过程中两个不同来源但具有同源性的核酸分子形成杂合双链的过程。当前90页，总共151页。当前91页，总共151页。

根据检测对象的不同，分子杂交可分为Southern杂交、Northern杂交和Western杂交，以及由此简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。当前92页，总共151页。3.1Southern杂交

根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫DNA印迹杂交技术。由E.Southern1975年设计，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。

印迹转移（blotting)：通过电泳将DNA、RNA或蛋白质样品进行分离，使不同相对分子质量的的分子在凝胶上展开，然后将凝胶上的样品通过影印的方式转移到滤膜上的过程称为印迹。当前93页，总共151页。Southern杂交流程图样品制备电泳杂交转膜结果显示探针制备当前94页，总共151页。（一）Southern杂交的操作步骤1.预处理：（1）用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切。（2）将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。（3）将电泳出来的凝胶泡在强碱溶液中，此时双链的DNA样品变性成单链DNA结构。（4）用酸中和，使单链DNA维持其单链状态（5）大片段DNA脱嘌呤，0.2NHCl。2.原位转移：将凝胶上的单链DNA转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上。（毛细管、电转移、真空转移）当前95页，总共151页。当前96页，总共151页。当前97页，总共151页。当前98页，总共151页。3.固定：在真空烤箱里，80℃下烤1-3h或紫外线照射或微波烘烤，将核酸样品进一步固定在滤膜上。4.杂交：杂交之前须有一个预杂交，封阻膜的背景，避免杂交时背景吸附探针。（鱼精DNA或脱脂牛奶）将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，溶液上的单链DNA分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。当前99页，总共151页。5.漂洗：将滤膜上没有和单链DNA样品结合的游离的探针分子漂洗下来，此后滤膜上只有杂交分子。6.放射自显影：在X光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。7.比较鉴定：将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与探针分子结合的DNA分子是凝胶上DNA链的那个片段。当前100页，总共151页。放射自显影DNA印迹转移探针杂交－＋当前101页，总共151页。SouthernBlotting的过程1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA3.固定胶中的DNA4.预杂交和杂交(放射性和荧光检测)5.结果检测当前102页，总共151页。

Southern印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。

Southern杂交主要用于判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。（鉴定特定的目的基因）当前103页，总共151页。当前104页，总共151页。当前105页，总共151页。

1.硝酸纤维素滤膜在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它存在一些不足之处:

（1）硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜进程，DNA会慢慢脱离硝酸纤维素滤膜，从而使杂交效率下降。（二）Southern杂交的杂交滤膜当前106页，总共151页。（2）硝酸纤维素滤膜质地较脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎(特别是经烘烤后)。（3）硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合DNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。（4）硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段(特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。当前107页，总共151页。2.尼龙膜优点：结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合。尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂交。缺点：杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高。当前108页，总共151页。3.2Northern杂交将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳转膜：不需变性当前109页，总共151页。Northern杂交的过程

①提取总RNA。②分离mRNA。利用亲和层析的原理纯化mRNA。③制备RNA探针。根据mRNA序列合成同源DNA探针，或以cDNA为探针。④Northern杂交。Northern杂交的方法包括点杂交和印迹杂交，两者都能鉴定外源基因是否得到转录，但后者还能确定mRNA分子质量大小及丰度。当前110页，总共151页。当前111页，总共151页。

Northern杂交的应用：

（1）检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；（2）mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）

当前112页，总共151页。3.3Westen杂交

其杂交总体过程与Southern杂交相似，只是在印迹转移过程中转移的是蛋白质而不是DNA。

Westen杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。当前113页，总共151页。主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：硝酸纤维素膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白与第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应当前114页，总共151页。当前115页，总共151页。当前116页，总共151页。当前117页，总共151页。3.4其他分子杂交

以上三种分子杂交可以获得较精确的结果，但在操作程序上比较繁琐，当样品量很大时，难以满足实验的需要。为此，当检测大量样品时可以采用简化的方式做初步的检测，如菌落杂交、噬菌斑杂交、斑点杂交和狭线杂交，然后再对阳性样品作精确的测试。当前118页，总共151页。一、菌落杂交将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落→对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA释放出来，并使之固定在滤膜上→通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA。菌落杂交主要用来从通过质粒或黏粒载体构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，再通过Southern杂交进一步验证。这种方法在一张直径为9cm的滤膜上，可检测几百到几千个菌落，达到高通量筛选的目的。当前119页，总共151页。图2—3检测重组体克隆的菌落杂交技术(a)将硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的DNA转移到滤膜上；(b)取出滤膜，做溶菌、碱变性、酸中和等处理后，置80℃下烤干；(c)带有DNA印迹的滤膜同32P标记的适当探针杂交。以检测带有重组质粒（含有被研究的DNA插入片段）的阳性菌落；(d)将放射自显影的X光底片同保留下来的原菌落平板对照，从中挑出阳性菌落供作进一步的分析研究当前120页，总共151页。二、噬菌斑杂交噬菌斑杂交与菌落杂交相似，只是所检测的不是菌落而是噬菌体。主要用来筛选λ噬菌体载体构建的基因文库中的阳性重组体，通过Southern杂交进一步验证后可获得所需要的目的基因。当前121页，总共151页。三、点杂交其是分子杂交中最简单的一种，直接将DNA或RNA分子以斑点的形式固定在滤膜上，进行分子杂交。其杂交的信号比菌落杂交和噬菌斑杂交受到蛋白质等细胞成分的干扰小，其结果的可靠性更强。当前122页，总共151页。四、狭线杂交其是在斑点杂交的基础上改进而来的，只是点种核酸样品的方式不同。可用于对mRNA进行定量比较，从而比较目的基因的表达强度。当前123页，总共151页。3.5杂交探针的获得

杂交探针是指经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA/RNA序列，用于核酸杂交可检测特定的基因或转录产物。探针（probe）可以是DNA、RNA或寡核苷酸，可以是单链也可以是双链（在使用前先变性成为单链）。

当前124页，总共151页。一、制备特异性探针所需要的基本条件1.被检基因结构清楚；2.有明确的基因产物;3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。当前125页，总共151页。二、探针的标记

将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的标识物：

放射性同位素标记（32P,35S,3H-dNTP等）：灵敏度高，成本低,但操作不便，标记效率不太稳定，寿命受半衰期限制

非放射性标记（地高辛、生物素、荧光素等）：安全，标记稳定，探针寿命较长，但灵敏度较低，背景较高，成本高当前126页，总共151页。1、缺口平移法（NickTranslation）原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。当前127页，总共151页。NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP

Bio-dNTP当前128页，总共151页。2、随机引物法（6核苷酸引物标记法）

原理及过程：利用由六个核苷酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物，在Klenow酶的作用下对待标记DNA进行随机扩增。Klenow具有5’→3’聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’→5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。当前129页，总共151页。随机引物标记探针5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP变性-复姓当前130页，总共151页。****探针制备****当前131页，总共151页。非放射性标记：地高辛标记地高辛可以与dNTP连接成地高辛-dUTP(UTP)等，参入DNA(RNA)的合成过程，形成地高辛标记的DNA(RNA)探针。利用抗地高辛的抗体通过酶联免疫反应来完成。当前132页，总共151页。探针检测原理地高辛探针序列待测基因地高辛抗体酶底物产物探针DNA用地高辛标记。地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个显色反应。地高辛抗体与地高辛结合。当前133页，总共151页。偶联酶及其底物：碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）当前134页，总共151页。当前135页，总共151页。转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增第五节重组DNA分子导入大肠杆菌当前136页，总共151页。5.1转化的原理与技术5.1.1Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术.其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态

当前137页，总共151页。大肠杆菌感受态细胞的制备：100ml菌体培养至OD600=0.5,离心收集菌体

用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液悬浮菌体冰浴放置12-24小时，备用当前138页，总共151页。大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组DNA连接液，混匀冰浴放置半小时

在42℃保温2分钟（热脉冲）

快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟加入1ml新鲜培养基,于37℃培养1小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板