荧光法测定药片中维生素含量

荧光法测定药片中维生素含量第一页，共二十六页，2022年，8月28日荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量实验目的学习荧光分光光度法测定药片中维生素B2的分析原理。掌握荧光分光光度计的操作技术和测定药片中维生素B2的方法。掌握Origin绘图软件的使用方法第二页，共二十六页，2022年，8月28日实验原理荧光分析法

常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。

第三页，共二十六页，2022年，8月28日实验原理荧光分析法

在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。第四页，共二十六页，2022年，8月28日a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。荧光分析法的特点第五页，共二十六页，2022年，8月28日激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。荧光光谱激发光谱第六页，共二十六页，2022年，8月28日发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。荧光光谱发射光谱第七页，共二十六页，2022年，8月28日荧光分析仪器

常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：液槽显示器单色器检测器I0IIf光源单色器第八页，共二十六页，2022年，8月28日荧光分析仪器

荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。第九页，共二十六页，2022年，8月28日a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。仪器部件第十页，共二十六页，2022年，8月28日

维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。药液维生素B2含量的测定第十一页，共二十六页，2022年，8月28日

维生素B2溶液在430～480nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

第十二页，共二十六页，2022年，8月28日光黄素第十三页，共二十六页，2022年，8月28日实验预习预习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理。了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B2的方法。第十四页，共二十六页，2022年，8月28日F-4500型荧光光度计（日本日立公司）10mL具赛试管10只，移液枪1只，100mL容量瓶2只5×10-5g·mL-1VB2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR），药用VB2试样(5×10-4g·mL-1)仪器与试剂第十五页，共二十六页，2022年，8月28日1.打开计算机，先接通电源开关（POWER），5秒钟后再按下Xe

LAMP按钮，再接通主开关（MAIN），此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作软件。2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。3.样品测定。4.关机顺序：逆开机顺序实施操作。基本操作第十六页，共二十六页，2022年，8月28日1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：在10个干净的10mL具赛试管中，分别吸取25、50、75，100、125、150、175、200uLVB2标准溶液，用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。实验步骤第十七页，共二十六页，2022年，8月28日2.未知试样的测定:在两支10mL具赛试管中，分别移取100uL试样,用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。实验步骤第十八页，共二十六页，2022年，8月28日1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。2.根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中VB2含量。数据处理第十九页，共二十六页，2022年，8月28日1.解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。2.维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？注意事项和问题第二十页，共二十六页，2022年，8月28日1、

波长扫描（Wavelength

Scan）

对样品进行激发波长或发射波长的扫描。

点击快捷栏“Method”,显示出“AnalysisMethod”的五个命令，分别为General(常规)、Instrument(仪器条件)、Monitor(模拟监测)、processing(处理方法)、Report(报告格式)，输入相应数据。附录：仪器操作软件有关说明第二十一页，共二十六页，2022年，8月28日1.1

GeneralMeasurement-----选择Wavelength

1.2Instrument

Scan

mode------输入扫描方式

Data

mode------输入数据采集方式

EM

WL------输入发射波长

EX

Start

WL------输入激发起始波长

EX

End

WL------输入激发终止波长

EX

WL------输入激发波长

EM

Start

WL------输入发射起始波长

EM

End

WL------输入发射终止波长附录：仪器操作软件有关说明第二十二页，共二十六页，2022年，8月28日Scan

speed------扫描速度选择

Delay------延迟时间

EX

Slit------激发单元狭缝

EM

Slit------发射单元狭缝

PMT

Voltage------光电管负高压

Response------响应速度

Corrected

spectra------光谱校正

Shutter

control------光闸控制

Replicates------重复次数

Cycle

time------循环周期附录：仪器操作软件有关说明第二十三页，共二十六页，2022年，8月28日1.3

MonitorY-AxisMax----纵轴标尺上限值

Y-AxisMin----纵轴标尺下限值

2、时间扫描（Time

Scan）

此扫描方式是EX,EM的波长均固定，仅观察样品随时间的变化。模拟画面的横坐标为时间单位，进入方法与波长扫描相同。

2.1GeneralMeasurement----选择Time

Scan

2.2Instrument

Data

mode------数据采集方式

EX

WL----设定激发波长EM

WL----设定发射波长

Time

unit----时间单位Scan

time----扫描周期附录：仪器操作软件有关说明第二十四页，共二十六页，2022年，8月28日2.3其它与波长扫描相同，从略。

3、光度法（Photometry）

也称工作曲线法，是定量测量方法。有六个子命令，分别为General、Quantitation、Instrument、Standards、Monitor、Report,输入相应测量条件后进行测量。

3.1General

Measurement------选择Photometry

附录：仪器操作软件有关说明第二十五页，共二十六页，2022年，8月28日3.2

Quantitation

Quantitationtype------选测量类型

Calibra