荧光探针和分子传感器

荧光探针和分子传感器第一页，共六十五页，2022年，8月28日200507051郭祥群博士，博士生导师全国高校化学教育研究中心第四届学术委员会副主任，教育部高等学校本科教学工作水平评估专家，中国化学会理事先后获得国家级奖2项，省部级奖4项，发表科研与教学研究论文100余篇。研究兴趣：荧光光谱分析的原理与技术，在研项目涉及生物活性自由基的荧光表征，海洋污染生物监测技术研究，食品安全等。联系方式L),2187288(O),2182355(H)第二页，共六十五页，2022年，8月28日200507052FluorescentProbesIntroductionFluorescentSensor

荧光传感FluorescentTracer荧光示踪

FRET

共振能量转移荧光Application

1.Radicalprobes2.Ionprobes3.NIRFFluorescenceimage4.DNAsequence5.Proteinprobes6.DNAprobes7.Membraneprobes8.pHprobes第三页，共六十五页，2022年，8月28日200507053ThankyouThankyou

第四页，共六十五页，2022年，8月28日200507054FluorescenceresearchKeyword:Fluorescen*Period:Jan/2005-Jun/2005Database:

美国化学会(ACS)数据库3566篇WPS电子期刊全文数据库206篇SDOS全文数据库（上交镜像）1890篇英国皇家化学会（RSC)数据库120篇研究与应用领域涉及：生命环境材料等讲座要求了解：荧光探针表征应用研究意义第五页，共六十五页，2022年，8月28日200507055MolecularProbeMolecularreporterFromJ.Fluorescence第六页，共六十五页，2022年，8月28日200507056Molecularprobes第七页，共六十五页，2022年，8月28日200507057JablonskidiagramT1hAhAAbsorption10-15sVibrational

relax,VR,10-1210-14sInternalconversion,IC,10-1110-13sIntersystemcrossing,ISC,10-210-6sFluorescencePhosphorescenceICISCS0S1S2321010-8s10-3100shFhPHOMOLUMO第八页，共六十五页，2022年，8月28日200507058CharacteristicsofFluorophoreExcitationwavelength激发波长

exEmissionwavelength发射波长

emExtinction(absorption)coefficient吸光系数Stoke’sshiftFluorescencelifetime荧光寿命Fluorescencequantumyield荧光量子产率

FluorescenceAnisotropy各项异性rFluorescencePolarization荧光偏振p第九页，共六十五页，2022年，8月28日200507059Excitationandemissionspectra1ExcitationspectrumEmissionspectraFemFexemex第十页，共六十五页，2022年，8月28日2005070510Fluorescencelifetimerelaxation(10-12s)S0S1S1hvAhvFknrSimplifiedJablonskidiagram

:EmissionrateKnr:nonradiativedecayrateDefinitionAveragelifetime:theaveragetimethemoleculespendsintheexcitedstatepriortoreturntothegroundstate.Expression第十一页，共六十五页，2022年，8月28日2005070511FluorescenceQuantumYieldDefinition

ThefluorescencequantumyieldistheratioofthenumberofphotonsemittedtothenumberabsorbedExpression

第十二页，共六十五页，2022年，8月28日2005070512Sensor(1)+SRTS信号单元，R识别单元，T靶分子hvhvhv自由基传感Z.-Y.Bian,X.-Q.Guo*,AnalyticalScience,21553-559,2005第十三页，共六十五页，2022年，8月28日2005070513Sensor(2)DDhue

-hvhvhvPETPhotoinducedElectronTransferhvHg2+E.M.Nolan,etal.,J.Am.Chem.Soc.,2003,125:14270-14271SRT第十四页，共六十五页，2022年，8月28日2005070514Sensor(3)RShvhvFRETFD,exD,emA,exA,emFD,exD,emA,exA,emT+hvhv’FluorescenceResonanceEnergyTransfer第十五页，共六十五页，2022年，8月28日2005070515ProbingDNAMolecularbeacons分子信标ADQFTargetDNAssDNAbindingproteinDenaturingreagentQFFQ第十六页，共六十五页，2022年，8月28日2005070516Sensor(4)+S-RThvhvAl3+hv第十七页，共六十五页，2022年，8月28日2005070517Sensor(5)+S-RT+竞争型+S-RT催化剂中间体+hvhv催化型第十八页，共六十五页，2022年，8月28日2005070518TheFusionofIntegalMembraneProtein荧光素标记鼠蛋白质罗丹明标记人蛋白质鼠细胞人细胞37°C15°C融合异核体FromInstantnotes,Biochemistry,E2Tracer膜内蛋白侧向运动第十九页，共六十五页，2022年，8月28日2005070519CelltracerA30µm–thicksectionofazebrafishembryostainedwithCellTrackerCM-DiI(C7000,C7001)priortoimmunohistochemicalanalysis.Aone-day-oldzebrafishembryowasimmobilizedandimpaledinthehindbrainwithamicroelectrodefilledwith1mg/mLCellTrackerCM-DiIin95%ethanol.Onedaylater,thebrainwasfixed,embedded,frozeninliquidnitrogenandsectionedonacryostat.Afterblockingwith0.1%TritonX-100inPBScontaining2%BSAand2%normalgoatserum,the30µm–thicksectionwasincubatedwithprimaryanti-glialantibodyinconjunctionwithfluoresceingoatanti–mouseIgGantibody.Thissectionwasthenviewedsequentiallythroughopticalfiltersetsappropriateforrhodamineandfluorescein,andtheresultingimagesweresuperimposed.TheimagewascontributedbyWilliamTrevarrow,BeckmanInstitute,CaliforniaInstituteofTechnology.C7000C68H105Cl2N3O荧光染色的斑马鱼胚胎第二十页，共六十五页，2022年，8月28日2005070520TracerAgF-AgAb抗体在免疫反应前后荧光探针自身的荧光量子产率不发生变化的情况测反应剩余的标记抗原，荧光正比抗原量测固相荧光，荧光反比抗原量测固相洗脱，荧光反比抗原量F标记抗原待测抗原∆—F∆—F荧光分子F∆∆∆∆—F∆—F∆第二十一页，共六十五页，2022年，8月28日2005070521FRET

FluorescenceResonanceEnergyTransfer第二十二页，共六十五页，2022年，8月28日2005070522PrincipleofFRETRateofenergytransferDquantumyieldofDDlifetimeofDr

distancebetweenAandDnrefrcativeindexNAvogadro’snumberk

orientationfactorJ

overlapintegral

FD,exD,emA,exA,em第二十三页，共六十五页，2022年，8月28日2005070523Orientationfactork=2/3randomizebyrotationaldiffusionpriortoenergytransfer第二十四页，共六十五页，2022年，8月28日2005070524FRETsensordesignbasedondonorandacceptordistancechangesK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413第二十五页，共六十五页，2022年，8月28日2005070525FRETprobingcAMPK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413cAMPcyclicadenosinemonophosphate环腺苷酸环腺苷酸依赖蛋白激酶支架结构四聚体表征cAMP第二十六页，共六十五页，2022年，8月28日2005070526FRETprobingPDE磷酸二酯酶BeforehydrolysisAfterhydrolysisK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413BeforeAfter香豆素phosphodiesterasehvhvhv第二十七页，共六十五页，2022年，8月28日2005070527EmissionspectraPDE第二十八页，共六十五页，2022年，8月28日2005070528FRETsensordesignbasedonmodulationofspectraloverlapFD,exD,emA,exA,emFD,exD,emA,exA,em有利于能量转移不利于能量转移第二十九页，共六十五页，2022年，8月28日2005070529Probingphosphatase磷酸酶LFabsQFabsDonorEmiLF(内酯）QF(醌型）K.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413PTP蛋白质酪氨酸磷酸酶香豆素荧光素第三十页，共六十五页，2022年，8月28日2005070530生物活性自由基研究的重要性•OHO2-•RO•ROO•NO活性氧自由基其他R•GS•为维持生命所必须过量产生会导致生物大分子损伤生命过程中所产生的自由基，是行使生理功能及介导其生化反应所必需的。如在线粒体呼吸链上电子传递过程中产生的自由基在线粒体能量代谢中起着重要的作用。第三十一页，共六十五页，2022年，8月28日2005070531•OH抽氢导致DNA断裂第三十二页，共六十五页，2022年，8月28日2005070532硫中心自由基引起细胞损伤第三十三页，共六十五页，2022年，8月28日2005070533顺磁标记荧光探针-ProbingfreeradicalParamagnetic(Lowfluorescence)Diamagnetic(Highfluorescence)产物抗磁性，稳定自由基之间的反应快速多功能探针：ESR；荧光（强度、偏振、寿命等）荧光显微技术应用于细胞、组织的自由基作用研究第三十四页，共六十五页，2022年，8月28日2005070534比率型荧光分子-ProbingNOSoh,N.etal.,Chem.Commun.,2002,2250-2251NO•FRETex=360nmem=470nmem=410nmex=360nm荧胺香豆素第三十五页，共六十五页，2022年，8月28日2005070535•OH比率型荧光探针-Probing•OHSoh,N.etal.,Chem.Commun.,2004,496-497以与自由基作用的特征靶分子或官能团作为识别基团荧光素罗丹明脱氧胸腺嘧啶核苷二聚体第三十六页，共六十五页，2022年，8月28日2005070536Ca2+indicatorFura-2Fura-Ca2+Fura钙具有使原生质胶体稳定以及调节细胞膜的结构和通透性的作用。对各种细胞的兴奋性具有正负效应。ExcitationEmission第三十七页，共六十五页，2022年，8月28日2005070537Ca2+indicatorIndo-1Indo-1-Ca2+第三十八页，共六十五页，2022年，8月28日2005070538ICTprinciple第三十九页，共六十五页，2022年，8月28日2005070539ImageofFura-2-Ca2+False-colorimage（假色成像）offreeCa2+concentrationinaPurkinjeneuron（梨状神经元）fromembryonicmousecerebellum（胚鼠小脑）Thecompositeimage,whichrepresentstheratioofimagesobtainedwithexcitationat340nmand380nm,revealsthemobilizationofinternalCa2+storeswithoutcontributionfromCa2+influx.Fura-2-Ca2+胚鼠小脑梨状神经元中游离Ca2+浓度荧光成像第四十页，共六十五页，2022年，8月28日2005070540ImageofspiralCa2+waveFluo-3(F1240)confocalimageofaspiralCa2+waveinitiatedbyinjectionofanonhydrolyzableanalogofinositol1,4,5-triphosphate（肌醇三磷酸非水解模拟物）inaXenopuslaevisoocyte（瓜蟾卵母细胞）.TheimagewascontributedbyDavidClapham,HarvardUniversity,andreproducedwithpermissionfromCell69,283(1992).瓜蟾卵母细胞中螺旋Ca2+波共焦荧光成像Fluo-3第四十一页，共六十五页，2022年，8月28日2005070541Na+indicatorSBFISBFISBFI-Na+海马切片CA1锥形神经元Na+成像第四十二页，共六十五页，2022年，8月28日2005070542Cd2+indicatorFluorescenceemissionspectraofamixtureof1µMBTC-5N(B-6845)and1µMTCPPinsolutionscontainingzeroto1.0µMCd2+.BTC-5N,tetrapotassiumsalt第四十三页，共六十五页，2022年，8月28日2005070543Zn2+indicatorAPTRA-BTC,tripotassiumsaltFluorescenceexcitationspectraofAPTRA-BTC(A-6895)insolutionscontainingzeroto25µMZn2+.第四十四页，共六十五页，2022年，8月28日2005070544pHindicator5-sulfofluoresceindiacetate,sodiumsalt(SFDA)第四十五页，共六十五页，2022年，8月28日2005070545DNA-basedpHsensorTatsuoOhmishietal.,Biochemistry2005,447125-7130第四十六页，共六十五页，2022年，8月28日2005070546TatsuoOhmishietal.,Biochemistry2005,447125-7130DNA-basedpHindicator表征MCF-7乳腺癌细胞编程性死亡过程ApoptosisMCF-7乳腺癌细胞第四十七页，共六十五页，2022年，8月28日2005070547荧光成像通过静脉注射或腹腔注射到生物体内的近红外荧光探针吸着并聚集于肿瘤等组织中，肿瘤中存在特异的细胞、蛋白质、酶等，这些物质可与荧光探针结合或反应而发出荧光，可根据荧光的位置、强度得知肿瘤的位置、大小，是否转移、扩散及肿瘤的阴性、阳性等一系列信息.第四十八页，共六十五页，2022年，8月28日2005070548近红外成像为什么选择近红外？第四十九页，共六十五页，2022年，8月28日2005070549GFP绿色荧光蛋白Endostatin内生抑制素Cy5.5花菁荧光染料NIR1,NIR2,GFP不同滤光片CY5.5标记的内生抑制素特异识别肿瘤第五十页，共六十五页，2022年，8月28日2005070550第五十一页，共六十五页，2022年，8月28日2005070551第五十二页，共六十五页，2022年，8月28日2005070552Self-quenchingprobeRalphWissleder,et.al.NatureAmerica1999,17:375-378酶活化酶作用位点C-PGC肿瘤伴生溶酶体蛋白酶特异识别自猝灭荧光探针（或细胞成像）多甲氧基聚乙烯乙二醇-聚赖氨酸-cy5.5(C-PGC),第五十三页，共六十五页，2022年，8月28日2005070553第五十四页，共六十五页，2022年，8月28日2005070554Phasecontrastimage相差成像NIRFimage肿瘤细胞成像NIRFNIRFLysosomalcompartment溶酶体分隔第五十五页，共六十五页，2022年，8月28日2005070555NIRFimage第五十六页，共六十五页，2022年，8月28日2005070556Template3’CCGGTAGCAACT5’Primer5‘GG3’GGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGGGCCATCGTTGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTdATPdCTPdGTPdTTPddATPdATPdCTPdGTPdTTPddCTPdATPdCTPdGTPdTTPddGTPdATPdCTPdGTPdTTPddTTPF1--AF2--CF3--GF4--TDNApolymerasedATP脱氧腺苷dCTP脱氧胞苷dGTP脱氧鸟苷dTTP脱氧胸苷ddATP双脱氧腺苷ddCTP双脱氧胞苷ddGTP双脱氧鸟苷ddTTP双脱氧胸苷FDNAsequence第五十七页，共六十五页，2022年，8月28日2005070557近红外成像荧光探针七次甲基花菁素类(图2，a)第五十八页，共六十五页，2022年，8月28日2005070558Proteinprobes蛋白质荧光探针RG对牛血清白蛋白（BSA）的响应图第五十九页，共六十五页，2022年，8月28日2005070559DNAprobeAbsorptionandfluorescenceemissionspectraofethidiumbromdeboundtoDNAEthidiumbromide溴化乙锭第六十页，共六十五页，2022年，8月28日2005070560DNAprobeHoechst33258(bis-benzimide)AbsorptionandfluorescenceemissionspectraofHoechst33258boundtoDNA.第六十一页，共六十五页，2022年，8月28日2005070561Normalandcamptothecin-treatedbovinepulmonaryarteryendothelialcells(BPAEC)werestainedwithC4-BODIPY500/510C9(B-3824andHoechst33258(H-1398,H-3569).BODIPYandHoechstfluorescencewererecordedusinglongpassfiltersappropriateforfluoresceinandDAPI,respectively.AnoverlayoftheimagesindicatesthataredshiftinBODIPYfluorescenceissignificantinnormalcells(leftpanel)comparedtothatinapoptoticcells(rightpanel,asindicatedbythefragmentednu