色谱分析的基本原理

第一页，共六十三页，2022年，8月28日§11.6

色谱的定性和定量分析第十一章色谱分析的基本原理§11.1概述(Overview)§11.2

色谱图的展开及相关术语§11.3

色谱分析理论基础§11.4

色谱理论§11.5

色谱分离条件的选择第二页，共六十三页，2022年，8月28日色谱法分离的基本原理是基于组分通过互不相溶的两相而达到分离的，即样品溶解在流动相(MobilePhase)中。从装填在柱子中或涂渍在载体表面的固定相(StationaryPhase)上通过，依据组分与固定相之间的相互作用力的不同。经过充分的运行时间，它们即可被分离。色谱法是一种分离技术，这种分离技术应用于分析化学中，就是色谱分析。一.色谱法分离的基本原理§11.1概述(Overview)第三页，共六十三页，2022年，8月28日分离原理：使混合物中各组分在两相间进行分配，其中一相是不动的，称为固定相，另一相是携带混合物流过此固定相的流体，称为流动相。当流动相中所含混合物经过此固定相时，就会与固定相发生作用。由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。流出的物质用相应的检测器进行检测。这种利用物质在两相间分配原理而使混合物中各组分分离，进而同时进行分析的技术称为色谱分析法，或色谱法（又称色层法，层析法）。第四页，共六十三页，2022年，8月28日最早的色谱分析法是俄罗斯植物学家Michail-Tswett在1906年，将碳酸钙装填在玻璃管(也称为色谱柱，Column)内，石油醚洗脱，用于分离植物叶子中的叶绿素，植物叶子的提取液在通过柱子后，在柱床上出现了不同颜色的色带，因此他将这种方法命名为色谱法(Chromatography)。这就是最早使用的柱色谱法。石油醚第五页，共六十三页，2022年，8月28日

外色谱法即柱色谱法(ColumnChromatography),即是说，在气相色谱、高效液相色谱或液体色谱中，所有的组分在相同的流动相推动下通过柱床，由于组分与固定相之间特殊的作用力，各个组分在柱后显示了不同的保留时间，并可用外部连接的检测器检测。1.依据展开后色谱图的类型，可将其分为:

内色谱法外色谱法。

内色谱即样品中的各组分在相同的时间内有不同的迁移距离。但最终的分离仍在柱床上，并可检测。这种类型的色谱法称为平板色谱，如纸色谱和薄层色谱。固定相涂敷在平板上，流动相通过毛细管力而移动或通过重力的影响而通过固定相。二.色谱法的分类第六页，共六十三页，2022年，8月28日2.根据固定相和流动相的不同，柱色谱的分类见下表：表11-1柱色谱法的分类流动相固定相色谱法气体固体GSC(气-固色谱)

液体GLC(气-液色谱)

液体固体LSC(液-固色谱)

液体LLC(液-液色谱）超临界流体SFC(超临界流体色谱)第七页，共六十三页，2022年，8月28日4.根据分离过程的机制的不同，色谱法又分为：吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法排阻色谱法3.根据固定相使用形式的不同，色谱法又分为：柱色谱法纸色谱法薄层色谱法第八页，共六十三页，2022年，8月28日一.色谱图的展开在柱色谱分离方法中最常用的是洗脱技术(ElutionTechnique)，在该法中，首先将样品溶解在流动相中，然后将其加入柱顶，最后用流动相洗脱，直到各个组分被分离，并在柱后检测。图11-1是样品A，B，C三组分的色谱分离洗脱示意图。§11.2色谱图的展开及相关术语第九页，共六十三页，2022年，8月28日A+B+CCCBCBACBAABC图11-1色谱洗脱原理图流动相第十页，共六十三页，2022年，8月28日当样品被加入柱上，样品就在两相之间进行分配，当流动相连续地加入柱顶，组分就在柱内新的流动相和固定相之间分配，与固定相的作用力强的组分比作用力弱的组分保留的时间长，经过一段时间的洗脱，它们即可被分离，并可在柱后以不同的时间顺序依次流出并分别被检测。在柱色谱中，根据检测信号与洗脱时间或洗脱体积的函数关系得到的图称为色谱图(Chromatogram)。柱中物质的谱带移动存在着两种趋向。峰间距的增加，和峰的扩展造成峰变宽。第十一页，共六十三页，2022年，8月28日A+B+CABCCBACBACCB图11-1色谱洗脱过程与色谱图t，minABC信号第十二页，共六十三页，2022年，8月28日原则上改进分离的条件为：

1、改变组分的移动速率；

2、峰的展宽降到最低限度与什么因素有关？（后面再讲）迁移速率峰的展宽第十三页，共六十三页，2022年，8月28日检测信号tRtM时间t图11-1色谱图中的相关参数二.色谱图的特征值第十四页，共六十三页，2022年，8月28日1.基线当色谱柱没有组分进入检测器时，在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的线称为基线。稳定的基线是一条直线。如图中的ot所示的线。基线漂移：指基线随时间定向的缓慢变化。基线噪声：指各种噪声所引起的基线起伏（波动）。2.保留值

保留值是用来表示试样中各组分在色谱柱中滞留时间的数值。通常用时间或用组分流出色谱柱所需流动相的体积来表示。第十五页，共六十三页，2022年，8月28日

死时间tM

指不与固定相作用（吸附，溶解）的物质（如空气，甲烷）从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间。死体积VM

指色谱柱在填充后柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相可以忽略不计时死体积可由死时间与色谱柱出口的载气体积流速F0(mL·min-1)来计算。

VM=tM·F0

保留时间tR指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间。调整保留时间

tR

´指被扣除死时间后的保留时间。第十六页，共六十三页，2022年，8月28日保留体积VR

指从进样开始到柱后被测组分出现浓度最大值时所通过的载气体积，即

VR=tR·F0调整保留体积VR´

指被扣除死时间后的保留时间。即；

VR´

=tR´

·F0VR´=VR-VM第十七页，共六十三页，2022年，8月28日相对保留值r2,1或

指某组分2的调整保留值与另一组分1的调整保留值之比：

r21亦可以用来表示固定相（色谱柱）的选择性。r21值越大，两组分的tR´相差也越大，分离也越好。

r21=1时，两组分不能被分离。r亦可用来表示。第十八页，共六十三页，2022年，8月28日图11-2色谱流出曲线图hh1/2YY1/20.607h区域宽度色谱峰区域宽度是色谱流出曲线中的一个重要参数。从色谱分离的角度看，希望区域宽度越窄越好。第十九页，共六十三页，2022年，8月28日利用流出的曲线（色谱图）可以解决以下问题：（1）根据色谱的位置（保留值）可以进行定性检定（2）根据色谱的面积或峰高可以进行定量测定（3）根据色谱峰的位置及其宽度，可以对色谱柱分离情况进行评价。

标准偏差即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半峰底宽度Y

自色谱峰侧的转折点所作切线在基线上的截距，如图2-3所示。它与标准差的关系为Y=4ó

半峰宽度Y1/2

又称半宽度或区域宽度，即二分之一峰高处对应的峰宽度，它与标准偏差的关系为

第二十页，共六十三页，2022年，8月28日§11.3色谱分析理论基础一.色谱分析的基本理论在气相色谱分析的流程中，多组分的试样是通过色谱柱而得到离的，那么这是怎样实现的呢？色谱柱有两种：一种是内装固定相的，称为填充柱，通常为用金属（铜或不锈钢）或玻璃制成的内径2-6mm/长0.5~10m的U形或螺旋形的管子。另一种是将固定液均匀的涂敷在毛细管的内壁上，形成中空的柱子，称为毛细管柱。第二十一页，共六十三页，2022年，8月28日在填充柱内填充的固定相有两类即气-固色谱分析中的固定相和气液色谱中的固定相。物质在固定相和流动相之间发生的吸附脱附和溶解挥发的过程称之为分配过程。气-固色谱分析中的固定相是一种具有多孔型及较大面积的吸附颗粒。吸附脱附气液色谱分析中的固定相是在化学惰性的固体颗粒表面，涂上一层高沸点的有机化合物，这种高沸点的化合物称为固定液。溶解挥发第二十二页，共六十三页，2022年，8月28日在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比称为分配系数K。一定温度下，各物质在两相间的分配系数是不同的。分配过程是色谱分离的依据。第二十三页，共六十三页，2022年，8月28日在实际工作中常应用另一表征色谱分配过程的参数—分配比。分配比亦称容量因子或容量比，是指在一定温度、压力下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相间的质量比，用k来表示：

式中VM和VS分别为柱中流动相和固定相的体积为容量比。第二十四页，共六十三页，2022年，8月28日（1）分配系数是组分在两相间分配达到平衡时的浓度之比，分配比则是组分在两相间的分配总量之比。（4）分配比与保留时间的关系若流动相在柱内的线速度为（cms-1),由于固定相对组分有保留作用，所以组分在柱内的线速度us将小于流动相的线速度u，则两速度之比称为滞留因子Rs（2）分配系数决定于组分和两相的性质，与两相体积无关。分配比不仅决定于组分和两相的性质，且与两相体积比有关。（3）对于一给定的色谱体系，组分的分离最终决定于组分在每相中的相对量，而不是相对浓度，因此分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数。第二十五页，共六十三页，2022年，8月28日显然Rs亦可用质量分数来表示：组分和流动相通过长度为L的色谱柱，所需时间分别为：又以上各式可得：流动相：不同组分的的k值不同，tR不同，因而可使各组分得一分离。组分：第二十六页，共六十三页，2022年，8月28日§11.4色谱理论试样在色谱中的分离过程的基本理论包括两个方面：1.试样中各组分在两相间的分配情况---热力学过程2.试样中各组分在色谱柱中的运动情况---动力学过程第二十七页，共六十三页，2022年，8月28日一.塔板理论为讨论方便，假设：塔板数为10,进样量：1mg,k=1即p=q。塔板理论假定：（1）平衡迅速（2）脉动式进载气，一次一个板体积（V）（3）试样开始加在零号塔板上，纵向扩散可忽略不计（4）分配系数在塔板上是常数引用了处理蒸馏过程的概念、理论和方法来处理色谱分离过程：将连续的色谱过程看作是许多小段平衡过程的重复。第二十八页，共六十三页，2022年，8月28日塔板号01234567891mg进样(平衡前)0.5mg(平衡后)0.5mg(平衡前)1V0.5mg0.5mg0.25mg(平衡后)1V0.25mg0.25mg0.25mg(平衡前)2V0.25mg0.25mg0.25mg0.25mg0.125mg(平衡后)2V0.25mg0.25mg0.125mg0.125mg0.125mg0.1250.250.125(平衡前)3V0.1250.250.125(平衡后)3V

0.0630.1870.1870.063

0.0630.1870.1870.063(平衡前)4V

0.0630.1870.1870.063

0.0630.1870.1870.063(平衡后)4V

0.0320.1200.1870.120.032

0.0320.1200.1870.120.032(平衡前)5V

0.0320.1200.1870.120.032

0.0320.1200.1870.120.032(平衡后)5V

0.0160.0760.1430.1430.0760.016

0.0160.0760.1430.1430.0760.016(平衡前)6V

0.0160.0760.1430.1430.0760.016

0.0160.0760.1430.1430.0760.016(平衡后)6V

0.0080.0460.1100.1430.1100.0460.008

0.0080.0460.1100.1430.1100.0460.008(平衡前)7V

0.0080.0460.1100.1430.1100.0460.008

0.0080.0460.1100.1430.1100.0460.008(平衡后)7V0.0040.0270.0.0780.1260.1260.0780.0270.0040.0040.0270.0.0780.1260.1260.0780.0270.004第二十九页，共六十三页，2022年，8月28日x0.050.100.15N51015组分从n=10的柱中的流出曲线图图11-3色谱保留图第三十页，共六十三页，2022年，8月28日此式成为流出曲线方程式。式中c0为进样浓度，tR为保留时间，

为标准偏差，

c为时间

t时的浓度。

第三十一页，共六十三页，2022年，8月28日由塔板理论可导出n与色谱峰峰底宽度的关系：式中色谱柱的长度L，tR及Y1/2或Y用同一单位（时间或距离)第三十二页，共六十三页，2022年，8月28日考虑到死时间不参与柱内的分配，提出了有效塔板数的概念：1.色谱峰越窄，塔板数n越多，理论塔板数H就越小，此时柱效能越高，因此n和H可一作为描述柱效能的一个指标。2.n有效和H有效能较为真实地描述柱效能的好坏。*同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的。第三十三页，共六十三页，2022年，8月28日通常用塔板高度和塔板数来评估色谱柱的柱效。所以，塔板理论可以近似描述柱内过程的实际情况。塔板理论在解释流出曲线的形状（呈正态分布），浓度极大点的位置及计算和评价柱效等方面都取得了很大的成功。速率理论但它在某些方面的基本假设是不成功的：纵向扩散忽略分配系数与浓度无关迅速达到平衡塔板高度和塔板数受那些因数的影响

不同的流速下测得不同的理论塔板数不能很好的解释第三十四页，共六十三页，2022年，8月28日

溶质在柱内移动过程中存在着有限的传质过程,色谱峰在朝前运动的同时还存在纵向扩散，这种影响与溶质在两相中运行速度（传质过程）有关，1956年荷兰学者范弟姆特(VanDeemter)等人在研究气相色谱时，提出了色谱过程的动力学理论-速率理论。该理论吸收了塔板理论中塔板高度的概念，并同时考虑色谱过程中影响塔板高度的动力学因素，指出填充柱的柱效受分子扩散，传质阻力和载气流速等因素的控制。速率理论指出，谱峰变宽受到三个动力学因素的控制，即涡流扩散项，分子扩散项，传质阻力项。二.速率理论--范弟姆特方程式第三十五页，共六十三页，2022年，8月28日常用几种不同的近似数学模型来解释，在工程领域中转换成色谱过程—范氏方程(VanDeemterEquation)式中是流动相的平均线速A，B，C为三个常数。其中A为涡流扩散项，B为分子扩散系数，C为传质阻力系数。H为塔板高度。

*u一定时，只有当A，B，C较小时，H才能最小,柱效才会高。

**而当A，B，C为一定时，对于H的影响则呈双向性。

第三十六页，共六十三页，2022年，8月28日（一）涡流扩散项A常数A称为涡流扩散(EddyDiffusion)，当流动相碰到填充物颗粒时，不断的改变流动方向，使试样组分在流动相中形成类似“涡流”的流动，因而引起色谱峰的扩张。A=2dPA与填充物的平均颗粒直径dP（单位为cm)的大小和填充的不均匀性有关。对于空心毛细管柱A等于0。第三十七页，共六十三页，2022年，8月28日

涡流扩散现象第三十八页，共六十三页，2022年，8月28日（二）分子扩散项试样组分被带入色谱柱后，是以塞子的形式存在与色谱柱的很小一段空间中，在塞子的前后存在着浓差而形成浓度梯度，因此使运动着的分子，发生纵向扩散。B与路径弯曲因子及组分在流动相中的扩散系数D有关。对于气相色谱：

B=2DgB项受纵向扩散的影响，该项使峰中心向前后的扩散，与颗粒的大小无关，直接与溶质在流动相中的扩大散系数成正比，与溶质的摩尔质量成反比。在液相色谱中B项几乎与流动相的流速无关。在气相色谱中，B项是非常重要的。在纵向扩散的影响中，塔板高度与流速成反比，也就是说，随着流动相流速的提高，塔板高度H变小，柱效提高。第三十九页，共六十三页，2022年，8月28日B.相应的检测信号A.柱内谱带构型第四十页，共六十三页，2022年，8月28日流动相的传质阻力CM和固定相的传质阻力CS。如为气相色谱则为Cg和Cl之和。

在传质阻力项中，随着流动相流速的提高，塔板高度H增大。流动相的线速度的影响与纵向扩散项相反，也就是说，由于溶质在两相中的传质需要一定的时间，常常流动体系并不能即可达到平衡，所以，当提高流速时，传质过程便显得更加重要了。（三）传质阻力项Cu第四十一页，共六十三页，2022年，8月28日在流动相中的传质阻力项CM它表示了流动相中溶质的传递能力。在一定的色谱条件下，它与涡流扩散是相关的，与溶质在流动相中的扩散系数成比例，直接依赖于填料的颗粒大小，且与柱直径大小有关.

固定相传质阻力项CS分为两种不同的情况，一种是涂渍在载体表面的固定液；另一种是固体固定相。在气-液相分配中随着液膜厚度的提高而增大，随着在固定相中的扩散系数变小而变小。较厚的液膜和较小的扩散系数使溶质在到达界面的速度变小。传质变慢，传质阻力项变大。如果固定相是由固体材料组成的，那么传质阻力系数Cs与吸附和脱附速度有关。第四十二页，共六十三页，2022年，8月28日气液色谱中组分在流动相和固定相中的传质过程担体流动相担体流动相流动相流动相担体担体固定液膜固定液膜固定液膜固定液膜从流动相到界面从界面进入固定液从固定液到界面从界面到流动相第四十三页，共六十三页，2022年，8月28日第四十四页，共六十三页，2022年，8月28日第四十五页，共六十三页，2022年，8月28日可变因素符号单位流动相的流速ucm／s在流动相中的扩散系数DMcm2／s在固定相中的扩散系数DScm2／s填料的直径dpcm液膜的厚度dfcm溶质的脱附速度tds柱子的直径dccm表11-2色谱中影响柱效的因素第四十六页，共六十三页，2022年，8月28日欲使塔板高度H最小，分离效率最高。需选择以下条件：1、较小的颗粒或较薄的液膜厚度；2、柱床填充均匀致密；3、较小的柱直径；4、在固定相中要有大的扩散系数Ds，在流动相中要有小的扩散DM。气相色谱分析时可用降低柱温来减小溶质在流动相中的扩散系数。由于不同大小的分子有不同的扩散系数，峰的扩展也依赖于相对分子量的大小，小分子的溶质有利于柱效提高。表11-3影响峰扩展的各种动力学因素涡流扩散A纵向扩散B/u液体固定相中传质项Cs.u流动相中传质阻力项CM.u第四十七页，共六十三页，2022年，8月28日一.分离度(Resolution,RS)§11.5色谱分离条件的选择色谱分离的两种情况ttSS如何评价？第四十八页，共六十三页，2022年，8月28日

R值越大意味着相临两组分分离得越好。而两组分保留值的差别主要取决于组分在流动相和固定相分配的热力学性质：色谱峰的宽窄则反映了色谱过程的动力学因素，柱效能的高低。因此分离度是柱效能选择性影响的总和，可用其作为色谱柱的总分离性能指标。分离度：分离度是用来衡量两个组分分离好坏的程度，定义为：有时也用下式表示：第四十九页，共六十三页，2022年，8月28日对于对称峰：当Rs<1.0时，两峰总有部分重叠而达到基线分离的分离度Rs1.5对于不对称的峰形要达到完全分离需要更高的分离图11-6A、B混合物的色谱分离图第五十页，共六十三页，2022年，8月28日二.色谱分离基本方程式因为Y1与Y2近似相等，等于Y2第五十一页，共六十三页，2022年，8月28日因为Y1与Y2近似相等，等于Y2第五十二页，共六十三页，2022年，8月28日定性分析的依据：

1.组分在固定床上的位置（内色谱法）

2.组分保留时间或保留体积（外色谱法）

3.色谱技术与其它光谱技术连用。

气相色谱--质谱检测器（GC-MS）高效液相色谱--紫外二极管阵列检测器

--红外光谱检测器（HPLC-IR）*虽然保留值与光谱波长精度相比其重现性差些。但是可以通过与标准化合物相比较，判断该物质是存在或不存在。一、定性分析(QualitativeAnalysis)§11.6色谱的定性和定量分析第五十三页，共六十三页，2022年，8月28日

1.用色谱图上的斑点面积定量。

2.用峰高定量必须保证在改变色谱条件下峰形不变化。另外，峰高必须与样品的浓度成正比。可变的条件如柱温，流速和进样体积必须精确控制。此外，也应避免加样量的超载。

3.用峰面积定量峰的展宽对定量结果没有影响，常用计算机辅助积分计算。也可以用手工的方法来近似测量峰高和半峰宽(h1／2)。但是如果峰很窄，则测定的峰面积问题较大。二、定量分析(QuantitativeAnalysis)第五十四页，共六十三页，2022年，8月28日1.峰面积测量法峰高乘半峰宽法：近似的：A=h·Y1/2

实际的：A=1.065h·Y1/2峰高乘